Genome-Editing in der Pflanzenzüchtung

GG Reiter Themenkomplex 185: Mutagenese [S. XXXIII:77].

Biotechnologisches und biologisches Detailwissen mit juristischer Deutung

Kap XVI. A. »Molekulargenetik für Juristen*«, S. XVI:1 f.

Kap XVI. D. »Genetik im Überblick«, S. XVI:12 ff;

Kap XVI. H. »GT vs NPBT vs BSN-Verfahren«, S. XVI:26 ff;

Kap XIX. »CRISPR/Cas-System«, S. XIX:11 ff

Kap XXIV. »Genome-Editing in der Pflanzenzüchtung«, S. XXIV:53 ff;

Kap XVIII. A. »Wissenschaftliche Entwicklung der SynBio«, S. XVIII:3 ff.

Seit etwa 12.000 Jahren baut der Mensch Getreide an und züchtet Pflanzen, 11.900 Jahre davon mit doch sehr mäßigem Erfolg. Seit dem Aufkommen des »SMART Breeding«[1] im Jahre 2005 überschlagen sich die Ereignisse. Ein BSN-Verfahren löst das andere ab, die SynBio selbst steckt noch in den Kinderschuhen.

Abb 143: Regulatorischer Status der GE (SDN1, SDN2, SDN3) und des Gene Drive.[2]

Neue BioTech, darunter insb GE-Verfahren, ermöglichen es auch DIY-Biologen* als Privatpersonen bekannte Genloci in einer Pflanze aufzuspüren und dort gezielte Veränderung vorzunehmen. Die potentiellen Züchtungsszenarien sind scheinbar grenzenlos. Auch Kleinbäuerinnen* oder Kleingärtnern* wird es bald gelingen, bekannte und gewünschte positive Eigenschaften Sorten übergreifend oder innerhalb der Arten zu übertragen bzw synthetisch neu zu kombinieren. Gerade jene Pflanzen, die nicht zu den sog »cash crops«[3] zählen, könnten zugunsten der Biodiversität erhalten und kultiviert werden.

Neue ortsspezifische Mutagenese-Verfahren werden fälschlicherweise am Gefahrenpotenzial der klassischen GT-Transgenese bemessen. [4],[5],[6]

Ein Faszinosum der Forschung im Bereich der DIY-Bio liegt in der Reaktivierung spezieller Gene, die zwar im genetischen Band (Genom) des Wildtypus noch vorliegen, allerdings in stummer Form (silenced, muted). Bedenkt man, dass Informationen von Arten, die seit Jahrhunderten oder -tausenden nicht mehr existieren, immer noch als basencodierte (digitale) Informationen in der Erbanlage der Nachfahren aufscheinen und nur darauf warten reaktiviert zu werden, so wird das wahre, positive Innovationspotenzial evident. Die Reaktivierung von ausgestorbenen Lebensformen kann so wie die Schaffung neuer Spezies zu ökologischen und biodiversitären Problemen führen. Was einmal in der Natur vorgekommen ist, kann s heute aus biologischer Sicht zum Problem werden. Ob ein Wildtyp noch im Genpool eines Organismus vorhanden ist oder ein bereits ausgestorbenes Lebewesen ins Leben zurückgerufen wird, muss in der Risikoanalyse Berücksichtigung finden.

Viele DIY-Biologen* und BSN-Forscherinnen* sind längst auf der Suche nach natürlichen Resistenzgenen, die den Einsatz von Pestiziden (insb Herbizide, Fungizide) obsolet machen.

Vice versa kann man aber auch binnen kürzester Zeit eine homozygote Inaktivierung eines anvisierten Zielgens zustande bringen. Kreuzt man den Wildtypus iwF mit einer sog »Knockout-Mutante«, setzt sich dieser gezielt in den Nachkommen durch und zwar nicht nach den Mendel’schen Gesetzen zu 50%, sondern zu 100%. Damit ist aber auch eine natürliche Auskreuzung nicht mehr möglich, das heißt es bedarf zuverlässiger biotechnol Umkehrmechanismen als Sicherheitsmaßnahmen.

Nun ist die Theorie ein Stiefkind der Praxis und die Gefahr der völligen Elimination eines selektierten Gens aus einer Population innerhalb von wenigen Generationen ist nur bei Sorten/Arten denkbar, die territorialspezifisch sind. Die Reaktivierung alter Wildtypen kann für sich aus Sicht der Biodiversität problematisch werden, da auch sie existente Arten verdrängen können. Das Risiko ist mit zu bedenken.

Besteht bei neuen BSN-Verfahren und BSN-Produkten keine Vertrautheit oder substanzielle Äquivalenz zu Altbekanntem, sind die Parameter der Risikobewertungen neu zu definieren. Selbst bei rein synthetischen Konstrukten der SynBio ieS und auch der NanoTech, für die es keine biologisch oa biotechnol komparativen Grundlagen gibt, ist das potentielle Schadenspotenzial nicht unbeachtlich. Einzelfallprüfungen in neuen, beschleunigten Verfahren durchzuführen sein; unterdessen ist es, wenn auch nicht immer legitim, so ggfs gerechtfertigt, neue BSN-Verfahren und BSN-Produkte einstweilig nach dem GTR zu beurteilen.

Schwachpunkt der salomonischen Vorsichtsmaßnahme ist, dass das Vorsorgeprinzip nur im Anwendungsbereich eines Gesetzes Anwendung findet, welches dieses auch vorsieht.

Das Verschuldensprinzip des ABGB umfasst einen erhöhten Sorgfaltsmaßstab aus der Ingerenz- und/oder Verkehrssicherungspflicht heraus, und sollte iaR zur Falllösung von DIY-Bio-Sachverhalten genügen. Aber auch das Prinzip der Gefährdungshaftung lässt sich im Einzelfall argumentativ und rechtsdogmatisch vertreten.

Aus dem Vorsorgegrundsatz alleine die Anwendbarkeit des GTR selbst zu konstruieren ist unzulässig!

Die Möglichkeiten der DIY-Bio setzen einen politischen Auftrag, wobei ein sozialer Konsens über die Ausformung exakter Rahmenbedingungen bestehen muss, um die Chancen, die mit den Innovationstechnologien einhergehen optimal zu nutzen, ohne als Standort Europa ins ökonomische Hintertreffen zu gelangen und zugleich möglichst geringe Auswirkungen auf das Ökosystem in Kauf nehmen zu müssen.

Va zwei Aspekte sind bei allen rechtlichen Überlegungen zu berücksichtigen:

  • In Ländern außerhalb der EU (USA) werden mittels GE veränderte Pflanzen nicht als GVO/GVMO eingestuft, sofern keine transgene Fremd-DNA eingebracht wird.
  • Der Nachweis vieler DIY-Bio-Verfahren ist nicht möglich.

Bei der Beurteilung von DIY-Bio-Haftungsfragen lassen sich die Probleme des Verschuldens und der Schuld. der Rechtswidrigkeit und der Kausalität Schwierigkeiten zu erwarten.[7]

Die Majorität des Senats hat im zitierten Fall den Schluss gezogen, das Vorsorgeprinzip sei hins etwaiger Gefahren für die Gesundheit der Menschen und der Umwelt hinter die ökonomischen Interessen des Staates zu stellen. Ein Aspekt, der nach dem Größenschluss umso mehr zur Geltung gelangt, wenn sich zum wirtschaftlichen Gesichtspunkt, dem Binnenmarktprinzip, noch Argumente des Zukunfts- und Forschungsprinzips gesellen.

Chronologie der Methoden der Pflanzenzüchtung

Epoche Methode Kurzbeschreibung
Selektionszüchtung
12.000 v.Chr. Auswahl der ertragreichsten Wildgetreidearten und wiederholter Anbau.
10.000 v.Chr. Urweizen: Emmer und Einkorn
8.000 v.Chr. Genmutation! Hirse als Grundlage für ungesäuertes Fladenbrot. Hirse als Kollektivum für ein kleinfruchtiges Spelzgetreide. Erbgutveränderung von Teosinte-Getreide (Mexiko) mittels Kombination von Mutationen, wie sie in der Natur vorkommen: Vorläufer der heutigen Mais-Sorten.
5.000 v.Chr. Leinsamen (Samen des Flachs); bis ins 18 Jhdt. wichtigster Textilrohstoff, auch Lebensmittel und Grundlage für Leinöl.
4.000 v.Chr. Mais und Rispenhirse (China)
700 v.Chr. Roggen
seit 1000 Kohl
seit 1750 Zuckerrüben
Kreuzungszüchtung
seit 1900 Nutzung existenter Varianten und gezielte Selektion von Pflanzen nach den Mendel’schen Gesetzen(Erstpublikation 1866).
Hybridzüchtung
seit 1930 Geplante Kreuzungen zwecks genetischer Variation; va homozygote Inzucht.
Moderne Züchtungstechniken
ab 1950 Mutationszüchtung Ungerichtete Mutagenese Radioaktivität (chemischen Substanzen oder Gamma- oder Neutronenstrahlen)[8]
Gewebekulturen
ab 1960 Gewebekulturen Zell- und Gewebekulturen, Protoplastenfusion
Frühe nicht natürliche Gentechnik
ab 1978 Transgenese Transgenese ein gezielt selektiertes artfremdes Gen wird in einen anderen Organismus eingeschleust.; RNA-Interferenz
seit ~ 1994 Grüne Gentechnik Flavr-Savr-Tomate (Anti-Matsch-Paradeiser); US-Patent Calgene Inc. (später Monsanto, heute BAYER) bereits 1988.
Neue Züchtungstechniken – Gentechnologie und BSN
seit 2000 Mutationszüchtung Mittels (Eco-)TILLING wird eine Punktmutation in einem spezifischen Gen aufgespürt; es handelt sich um ein zielgerichtetes Mutagenese-Verfahren. (Arabidopsis-Genom)
seit 2005 SMART Breeding

(Präzisionszucht)
  • MAS[9]-Selektion (Genmarker gestützt)
  • Doppelhaploide, also Verdoppelung der Chromosomen
  • Zellfusion

Es erfolgt eine Genom-Analyse, um geeignete Kreuzungspartner zu finden. Kein Einbau artfremder Gene.
Cisgenese Übertragung von selektierten, isolierten Genen der arteigenen Spezies; es wird also ausschließlich innerhalb des pflanzeneigenen Genpools operiert.
Intragenese Ähnlicher Vorgang, wie bei der Cisgenese, allerdings erfolgt die Übertragung aus allen kreuzbaren Arten. Die eingebrachten Gensequenzen kommen im Ausgangsorganismus nicht vor (Intragene). Die neue DNA wird aus verschiedenen Fragmenten neu synthetisiert.
Agro-Infiltration

(floral dip)

 Rekombinante Agrobakterien (insb Agrobacterium tumefaciens) kommen zum Einsatz, um in Pflanzen kurzfristig eine Genexpression zu erreichen
RNA-Interferenz Gezielter Knock-out einzelner Gene durch RNAi Silencing.
Minichromosomen In-vitro-Gentechnologie. Isolierte Chromosomen (etwa 50 kBP) werden neu synthetisiert/konstruiert.
Metabolomik Analysenmethoden zur Erforschung charakteristischen Stoffwechseleigenschaften von der Zelle angefangen bis hin zu komplexen Organismen.
Pfropfen (Grafting) Konventionelle Züchtungsmethode, um Pflanzen zu veredeln. Die konventionelle Züchtung wird mit der GT kombiniert, um verbesserten Merkmale zu generieren.
RdDM Epigenetischer Prozess, der erstmalig in Pflanzen beobachtet wurde.
SynBio
  • SynBio iwS als Weiterentwicklung der Gentechnologie; es werden va synthetischen Komponenten (Bausteine der Natur) in einen Organismus eingebracht.
  • SynBio ieS es werden synthetische Organismen am Reißbrett entworfen und entwickelt; einen natürlichen Komparator gibt es nicht.
seit 2010 Genome-Editing Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese, ZFN-1; ZFN-2; ZFN-3, TALENs
seit 2012 Genome-Editing CRISPR/Cas9

Tab 43: Chronologie der modernen Pflanzenzüchtung[10],[11]

Seit den 1980er Jahren ist die transgene Pflanzenzüchtung als Methode bekannt. IwF haben sich mehrere Verfahren etabliert, wobei CRISPR/Cas9 die bevorzugte DIY-Bio-Methode ist. Sie hat mit den älteren GE-Verfahren gemein, dass zwei natürliche [biologische!] Reparaturmechanismen der Zelle zum Umprogrammieren des Genoms genutzt werden: HDR oder NHEJ.[12]

Trotz des EuGH-Urteils (Rs C-528/16) bleibt offen, welche mit nicht der Mutagenese zuordenbaren BSN-Verfahren erzeugten Organismen, im juristischen Sinne als GVO anzusehen sind und damit unter die Bestimmungen des GTR fallen.

Sorte Zuchtziel Verfahren Firma Regelung Freisetzung
Wachsmais Stärke CRISPR/Cas DuPont
Pioneer		 Bescheid: kein GVO Markteinführung in fünf Jahren
Speisepilze nicht braun anlaufend CRISPR/Cas Penn State Bescheid: kein GVO Vermarktung unklar
Weizen Resistenz gegen Mehltau TALEN Calyxt Bescheid: kein GVO Freilandversuche
Weizen weniger Gluten TALEN Calyxt noch kein Antrag gestellt Forschung
Sojabohnen weniger Trans-Fettsäuren TALEN Calyxt Bescheid: kein GVO Freilandversuche
Kartoffeln Produkte weniger Acrylamid TALEN Calyxt Bescheid: kein GVO Freilandversuche
Ananas rosa Farbe GT (RNAi) Del Monte USDA: keine Zulassung als GVO erforderlich Freilandversuche
Hirse Optimierung Bioenergie Gentechnik Ceres USDA: keine Zulassung als GVO erforderlich auf dem Mark

Tab 44: Neuartige Pflanzen, die in den USA nicht vom GTR erfasst sind.[13],[14]

Eigenschaften Modul Meganuklease ZFN TALEN CRISPR/Cas9
Komponenten Spezialität

Spaltung

 Zielerkennungsdomäne

Nukleasedomäne

 Zinkfinger-Domäne

unspezifische Fokl-Nukleasedomäne

 TALE-Domäne

unspezifische Fokl-Nukleasedomäne-ne

 CrRNA

Cas9-Enzym (Protein)
Länge der Zielsequenz (BP) 14-20 18-24 24-59 20-22
Zielerkennungseffizienz niedrig hoch hoch hoch
Spaltungseffizienz hoch hoch hoch hoch mit Multiplexing-Potenzial
Schwierigkeitsgrad und Aufwand Kompliziertes Prozedere. Redesign je Ziel (target site) erforderlich. Spezialkenntnisse der Molekularbiologie erforderlich. Relativ einfaches Prozedere. Design je Ziel (target site) erforderlich. Simple und rasches Prozedere. Design je Ziel (target site) erforderlich
Off-Target-Effekte mgl mgl mgl mgl

Tab 45: Vergleich der Genome-Editing-Verfahren.[15]

Nuklease-gestütztes Genome-Editing (SDN)

Das »Nuklease-vermittelte Genome-Editing« ist eine sequenzspezifische Induktion von DSB und umfasst bis dato vier biotechnol Methoden:

  1. Nukleasen Zink-Finger (ZFN)
    • synthetische Erkennungsdomäne
    • nicht punktgenau
    • komplexer Herstellungsprozess
  2. TALEN
    • Protein basierte Erkennungsdomäne basiert
    • Vorkommen in Xanthomonas Bakterien
    • Umbau bzw Adaption für Genschere
    • Länge der Zielsequenz nach Belieben
    • Auffinden de Zielsequenz exakter steuerbar als bei CRISPR/Cas Systemen
    • Protein ist genauer als guideRNA
  3. CRISPR/Cas
    • CRISPR-Sequenz basierte Erkennungsdomäne
    • CRISPR = Bauanleitung für crRNA
    • crRNA leitet das Cas9-Protein an die gewünschte Schnittstelle der Ziel-DNA
    • bis dato simpelste Genschere
    • Tauglichkeit für Multiplexing
  4. Meganuklease
    • Erkennungsdomäne basiert auf natürlich vorkommende aber modifizierten Enzymen
    • Zielgenauer als ZNF, weil längere DNA-Sequenzen erkannt werden und somit weniger Spielraum für Off-target Effekte besteht
    • Produktionsvorgang ist für die Forschungspraxis zu hoch.

Die Verfahren unterscheiden sich durch den Einsatz unterschiedlicher Enzyme. Im Grunde funktionieren sie in zwei Verfahrensschritten nach demselben Prinzip, nämlich dem gezielten Schnitt an einer Stelle im DNA-Strang und dem Auslösen des natürlichen [biologischen] DNA-Autoreparaturmechanismus in der Zelle an der betroffenen Sequenz.

Pars pro toto soll die seit Mitte der 1990er Jahre[16] bekannte ZFN näher beschrieben werden, weil sie aus rechtsmethodischer Sicht hins der Systematik und Historik der FRL bedeutsam ist. So sind »Gen-Knockouts« mittels ZFN Verfahren zum Zeitpunkt des Inkrafttretens der FRL bereits bekannt gewesen und praktiziert worden, womit die Begründung des EuGH falsch und somit unzulässig ist.[17]

Zink-Finger-Nuklease (ZFN-1, ZFN-2 und ZFN-3)

Vgl hierzu die CRISPR/Cas9 SDN-1-Technik: CRISPR/Cas-Verfahren Funktionsweise im Detail

Kap XIX. D. 5. a) »SDN-1: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XIX:25;

Kap XIX. D. 5. b) »SDN-2: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XIX:26;

Kap XIX. D. 5. c) »SDN-3: Gentechnik«, S. XIX:27.

S zur GE-Identifizierung

Kap XI. E. 19. e) »GE-Methode: Identifizierung«, S. 700.

Kleine DNA-Sequenzen können insertiert, deletiertoder ausgeschaltet werden.

Die ZFN sind Heterodimere[18] und bestehen aus einem Zink-Finger-Protein, das eine im Vorfeld bestimmbare DNA-Sequenz im Genom erkennt und an ihr andockt. Die zweite Nuklease (Designer Endonuklease) kann DNA-Stränge zerschneiden und zwar an einer exakt determinierbaren und anvisierbaren Zielsequenz. Dieses Enzym erkennt also die Stelle im Genom, schneidet den DS punktgenau und führt künstlich einen DSB herbei, den der eigene DNA-Autoreparaturmechanismus der Zelle erkennt und die Bruchenden wieder zusammengefügt.

Dem Bericht der EFSA zufolge können gentechnische Modifikationen im Zusammenhang mit Techniken der ZFN-1 und ZFN-2 auch mit TALEN oder Meganukleasen (MN) umgesetzt werden, weshalb sie jenen der SDN-1 und SDN-2 gleichzuhalten sind. Damit sind auch CRISPR/Cas-Techniken erfasst. Auch die ZFN-3-Technik entspricht jener der SND-3.[19]

Abb 144: Intendierte Reparaturergebnisse von DSB induziert mit SDN.[20]

ZNF-1: Gentechnik? im kleinen Rahmen

Vgl hierzu die CRISPR/Cas9 SDN-1-Technik: CRISPR/Cas-Verfahren Funktionsweise im Detail

Kap XIX. D. 5. a) »SDN-1: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XIX:25.

  • Keine Einflussnahme auf das zelleigene Reparatursystem.
  • An der neu zusammenfügten Bruchstelle entstehen Mutationen.

Mit der ZFN-1 Technik werden ortsspezifische Punktmutationen[21] generiert und zwar durch NHEJ; man kommt dabei ohne Reparatur-Matrize aus. Der DSB wird also durch den zelleigenen DNA-DSB-Autoreparaturmechanismus über NHEJ gekittet.

Das führt häufig – wenn auch nicht immer – zu einer singulären Basensubstitution bzw einer auf wenigen Bp bestehenden Substitution; aber auch kleine lokale Deletionen oder Insertionen können bewerkstelligt werden.

Im Falle der Insertionen, entstammt die Donor-DNA dem eigenen Genom, ist also nicht exogener Herkunft.

Die losen DNA-Enden des DSB können aber auch an nicht ortsspezifischen Stellen zusammengefügt werden, was in einer chromosomalen Translokation mündet. Auf diese Weise lassen sich randomisierte Punktmutationen[22] erzeugen.[23]

ZFN-2: Gentechnik? im kleinen Rahmen

Vgl hierzu die CRISPR/Cas9 SDN-1-Technik: CRISPR/Cas-Verfahren Funktionsweise im Detail

Kap XIX. D. 5. b) »SDN-2: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XIX:26.

  • Einbringen kurzer DNA-Sequenzen;
  • Die DNA-Sequenzen legen sich an den Bruchkanten des DNA-Strangs passgenau an, um dort als Matrize für das Reparatursystem zu dienen.
  • Mutationen werden gezielt herbeigeführt.

Mit der ZFN-2-Technik generiert man bewusst anvisierte ortsspezifische Punktmutationen[24] über den DNA-DSB-Autoreparaturmechanismus im Wege der HDR. Es handelt sich um spezifische Nukleotid-Substitutionen eines einzigen oder einiger weniger Nukleotide oder auch um kleine Deletionen bzw Insertionen.

Eine DNA-Sequenz wird zugleich mit der ZFN in die Zelle eingebracht. Die DNA-Reparatur-Matrize ist dabei homolog zum anvisierten Zielbereich und umfasst einige wenige KBp, die DSB-Region überlappen. Allerdings enthält die Matrize spezifische Bp-Alterationen, die iwF in die Ziel-DNA oder das Chromosom eingebracht werden. Die exogene Reparatur-DNA steht nun als Reparaturvorlage im Wettstreit mit den Schwesterchromatiden, was – selten aber doch – zum Austausch der originären Nukleotidsequenz führen kann. Den meisten Studien zufolge bestand das Ziel im Austausch eines Bp bzw einiger weniger Bp.

Es gibt stichhaltige Indizien dafür, dass die Reparatureffizienz linear mit der Zunahme der Entfernung zum DSB abnimmt; es kommt zu einer steigenden Anzahl an Fehlverbindungen. Das Ergebnis lässt sich mit den »Off-targets« anderer (zielgerichteter) ortsspezifischer Methoden der Mutagenese vergleichen.

ZFN-3: Gentechnik

Vgl hierzu die CRISPR/Cas9 SDN-1-Technik: CRISPR/Cas-Verfahren Funktionsweise im Detail

Kap XIX. D. 5. c) »SDN-3: Gentechnik«, S. XIX:27.

  • Einbringen längere DNA- Sequenzen: mehrere Kilo-Basenpaaren (KBP)
  • Einbau in das Genom im Zuge des Reparaturmechanismus.

Die ZFN-3-Technik basiert auf transgenen Insertionen über HDR. DNA-Fragmente oder Gen-Kassetten können, bis zu einer Länge von einigen KBp, punktgenau und ortsspezifisch in das Genom oder in das Gene eingebracht werden. In praxi wird ein rekombinantes DNA-Molekül konstruiert, in dem das ausgewählte DNA-Fragment oder die gewünschte Gen-Kassette als Donor-DNA zwischen Teilbereichen der DNA eingebracht wird, das homolog zur DNA der flankierenden DSB-Enden ist.

Die Donor-DNA kann dabei von anderen Spezies herrühren; sie wird zusammen mit der ZFN zielgenau in das Genom der Zelle am DSB eingebracht.[25]

ZFN gelangt seit geraumer Zeit in der Pflanzenzüchtung zum Einsatz. Erste Produkte stehen vor der Markteinführung.[26]

CRISPR/Cas9

Vgl hierzu die CRISPR/Cas9 SDN-1-Technik: CRISPR/Cas-Verfahren Funktionsweise im Detail

Kap XIX. D. 5. a) »SDN-1: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XIX:25;

Kap XIX. D. 5. b) »SDN-2: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XIX:26;

Kap XIX. D. 5. c) »SDN-3: Gentechnik«, S. XIX:27.

CRISPR/Cas9-Verfahren im Detail:

Kap XIX. »CRISPR/Cas-System«, S. XIX:11 ff.

Beim GE mit CRISPR/Cas9 wird eine sgRNA mit einem Cas9-Enzym in den Zielorganismus (Zelle) eingebracht, um einen DSB auszulösen. Diese durch Cas9 herbeigeführten Brüche werden wiederum durch den zelleigenen DNA-Autoreparaturmechanismus geflickt.

Die Genexpression in Pflanzenzellen kann entweder mithilfe von Vektoren oder über Mikroinjektionen von RNA für sgRNA und mRNA für Cas9 erfolgen. Die Übertragung geschieht somit entweder auf direktem Weg (Elektroporation) oder via Agenten (Plasmide).[27]

Diese effiziente Methode ist seit dem EuGH-Urteil (Rs C-528/16) im Gegensatz zu der ungerichteten Mutagenese nicht vom GTR ausgenommen.

TALEN

Kleine DNA-Sequenzen können insertiert, deletiertoder ausgeschaltet (Knockout) werden.

TALEN[28] sind künstlich hergestellte Restriktionsenzyme und bestehen aus zwei Protein-Komponenten:[29]

  • einerseits aus einer DNA-Bindungsdomäne, in Form eines fusionierten bindenden Proteins »TALE« und
  • andererseits aus einer unspezifischen Nuklease[30].

Das TALE-Protein übernimmt Lotsenfunktion, wobei es eine einzelne, spezifische Base der DNA erkennt, weil es mit jeder Bindedömäne – im Gegensatz zu ZFN[31] – eine der fünf Nukleobasen erkennt.

Sie bestehen aus einem Bereich, der DNA bindet sowie einem Enzym, das die ds-DNA schneiden kann. Jener Teil der die DNA bindet sequenzspezifisch an die Ziel-DNA. Die durch die Endonuklease geschnittene DNA funktioniert nicht so sequenzspezifisch, wie bspw das CRISPR/Cas9-System. Die Produktion von TALENs ist nicht schwer und auch recht schnell, allerdings etwas kostspieliger als CRISPR/Cas9, da jedes TALEN eigens entworfen und synthetisiert werden muss, womit das Verfahren für DIY-Biologen* nicht interessant ist.

In den USA sind bereits TALEN-Pflanzen ohne besonderen Auflagen zur Marktreife gebracht worden.[32] Im Unterschied dazu fällt da TALEN-Verfahren spätestens seit dem EuGH-Urteil (Rs C-528/16) unter das GTR. Es besteht eine Genehmigungspflicht für die Freisetzung sowie eine Kennzeichnungspflicht für Lebens- und Futtermittel.

Die Methode ist seit dem EuGH-Urteil (Rs C-528/16) im Gegensatz zu der ungerichteten Mutagenese nicht vom GTR ausgenommen.

Meganukleasen (MN)

Bei Meganukleasen handelt es sich um (modifizierte) Homing-Endonukleasen, die auch als Restriktionsenzyme bezeichnet werden. Sie sind Enzyme (Proteine), die in ihrer Sequenz die Nuklease-Funktionen wie auch jene der spezifischen DNA-Bindung tragen. Die lange Basensequenz von etwa 20 Basen ist namengebend. Eine Selektion in vitro ist allerdings zu kostspielig und bedarf eines erheblichen Zeitaufwands, weshalb diese Methode gerade im Vergleich zu CRISPR/Cas9 im Rahmen DIY-Bio keine Rolle spielt. Ob der extrem hohen Zielgenauigkeit kommen sie va im Bereich der »Roten Gentechnik« zur Anwendung.[33]

Die Methode ist seit dem EuGH-Urteil (Rs C-528/16) im Gegensatz zu der ungerichteten Mutagenese nicht vom GTR ausgenommen.

Oligonukleotid-Directed Mutagenese (ODM)

ODM[34] ist auch unter dem Begriff RTDS[35] oder als Verfahren der Oligonukleotid-gesteuerten Mutagenese (OgM) bekannt. Es handelt sich um ein ortsspezifisches Mutagenese-Verfahren, mit dem ein Nukleotid zielgerichtet verändert werden kann, es also zu einem Austausch von Aminosäuren an einem vordefinierten Protein kommt.[36] Beim ODM Verfahren werden etwa 20 bis 100 Oligonukleotide biosynthetisch produziert und in eine Zelle eingebracht, wo sie an einer spezifischen, zielgesteuerten Position im Genom eine Mutation einfügen, welche idR lediglich ein Bp oder einige wenige Bp umfasst.

  • So kann ein gezieltes Gen-Knock-out oder Gen-Knockin praktiziert werden oder
  • Proteine qua Veränderung der Aminosäuresequenz auf höchst effiziente Weise synthetisieren werden.

Va bei den Insertionen von kurzen DNA-Sequenzen handelt sich um zielgerichtete Punktmutationen.[37] Es wird vermutet, dass RNA-Oligonukleotide den DNA-Autoreparaturmechanismen als Matrize dienen und zu Mutationen führen.[38]

Moderne Techniken, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR),[39] können Mutationen recht exakt an prädefinierten Positionen der DNA hervorrufen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass weniger Off-target-Effekte eintreten, was den langwierigen und kostspieligen Prozess der Auskreuzung erheblich verkürzt; dasselbe gilt für CRISPR/Cas9-System. Spezifisch produzierte synthetische PCR-primer führen zur Abänderung der genetischen Information.

Die Einstufung mutagenisierter Nutzpflanzen ist vor dem Urteil des EuGH (Rs C-528/16) bereits in drei Staaten[40] erfolgt, allerdings mit einem konträren Resultat. Die veralteten Methoden der ODM hat das »US Department of Agriculture« (USDA) schon im Jahre 2004 mit der spontanen Mutagenese gleichgestellt und setzte diese iwF mit dem CRISPR/Cas-System gleich. Somit können Nutzpflanzen, die die gleichen Bedingungen erfüllen, wie sie von der ZKBS skizziert worden sind, in den USA

Dem EuGH-Urteil (Rs C-528/16) zufolge ist anzunehmen, dass auch OgM-Verfahren in den Anwendungsbereich der FRL fallen, obwohl die in die Zellen in-vitro eingebrachten Nukleinsäuren genomisch nicht integriert werden, sich also nicht im Erbgut niederschlagen. Damit sind sie aus produktspezifischer Sicht auch kein Genmaterial iSd FRL.

Cisgenese, Intragenese und Transgenese

Dieser Bereich ist in Kapitel ‎XVII. H. »Mutationen« ausführlich beschrieben, weshalb an dieser Stelle lediglich das für das Rechtsverständnis Nötigste herausdestilliert wird.

Gleich welche Form der Genese Anwendung findet, sollte die DIY-Bio an sterilen Pflanzen, die weder selbst fruchtbar (Pollen) noch berfruchtbar sind iSd der Forschungs- und Wissenschaftsfreiheit nicht generell vom GTR erfasst sein.

Aber auch biogenen Pflanzen,[41] die mit GE-Verfahren hergestellt werden, können durchaus im Einklang mit den Prinzipien der biologischen und ökologischen Landwirtschaft stehen. Sofern eine Auskreuzung der transgenen Eigenschaften unmöglich ist, bleiben nur die positiven Effekte übrig, weshalb schon sinngemäß kein ges Schutzbedarf bestehen kann.

Biogene Pflanzen lassen sich mit den nachfolgenden Methoden hervorbringen.

Cisgenese

Themenkomplex 186: Cisgenese [S. XXXIII:77].

Bei cisgenen Pflanzen handelt es sich grds um GVO, wobei lediglich arteigene Gene eingebracht werden. Das bedeutet, es kommt keine artfremde Donor-DNA zum Einsatz, sondern die Promotoren oder Terminatoren werden aus dem Erbgut der gleichen Pflanze bzw Pflanzenart extrahiert und isoliert. Anders als bei konventionellen Züchtungsmethoden müssen unerwünschte Elemente nicht wieder rückgekreuzt werden.

FB 214: Cisgenese: Schorfresistenter Apfel (§)

Plant Research International (PRI) in Wageningen (NL) forscht und experimentiert seit 2016 unter Anwendung der Cisgenese an einem schorfresistenten Apfel und hat letztlich den Apfel SQ159 (Natyra®) hervorgebracht. Der Apfelschorf ist eine Mykose, die das Blattwerk und die Früchte zugleich befällt. Das eingebrachte Resistenzgen stammt aus einer anderen, auf herkömmliche Weise gezüchtete Apfelsorte (Sibirischer Holzapfel) und wird in die Apfelsorte »Gala« eingebracht.[42]

Da der Gala Apfel keine Fremd-DNA enthält ist er cisgen und nicht transgen und wäre somit nach § 6 Abs 5 GTG höchstens in die Risikogruppe 1 einzustufen. Es werden Promotoren, Terminatoren und Reportergene derselben Pflanzengattung bzw -art eingebracht und keine natürlichen Kreuzungsbarrieren überschritten. Die Cisgenetik wird insb zur Transformation von Resistenzgenen aus Wildtypen in Kulturpflanzen angewandt. Da derartige Mutationen auch auf herkömmliche, natürliche [biologische!] Weise, also durch Kreuzung, erfolgen können, ist strittig, ob diese Methode überhaupt in den Anwendungsbereich des GTR fallen soll.

Als GE-Mutagenese-Verfahren ist die Cisgenese nicht vom Anwendungsbereich des GTR ausgenommen.

Aus juristischer Perspektive sollten cisgene Pflanzen als GVO ins Regime des GTR fallen, wären ggfs aber nicht nachverfolg- oder erfassbar.

Zumal natürliche Pflanzen nicht als Pathogene gelten und die Methode der Cisgenese mit den Merkmalen der Selbstklonierung übereinstimmen kann, ist die Argumentation, wonach die Cisgenese nicht zwingend GV-Verfahren sein muss und cisgene Pflanzen keine GVP sind, nicht von der Hand zu weisen.[43]

Selbst mit PCR-Methoden lässt sich das Verfahren nur nachweisen, wenn der Locus der Insertion des Intragens bekannt sind. Auch die intragene GVP kann nur dann mit PCR-Methoden erkannt werden. Kennt man sowohl die DNA-Sequenz und den Insertionslocus des Intragens, lassen sich intragene GVP mit PCR-Methoden identifizieren. Über eine methodenspezifische Anfertigung eines sog PCR-Primers kann eine konkrete Identifikationsmethode entwickelt werden.

Intragenese

Themenkomplex 187: Intragenese [S. XXXIII:77].

Die Intragenese ähnelt der Cisgenese in vielerlei Punkten, allerdings können die eingebrachten Gene auch von, taxonomisch nah verwandten Spezies stammen. Wenn es theoretisch unter natürlichen [biologischen!] Bedingungen auch zu einer Kreuzung der Ausgangs- und der Zielpflanze kommen könnte, dann könnte es uU auch zu einer Rekombination von DNA-Fragmenten kommen, denn die Kreuzungskompatibilität ist ja grds gegeben. In praxi werden Gene artifiziell mit verschiedenen Promotoren und Operatoren kombiniert und synthetisiert. Im Ergebnis entsteht ein gentechnisch verändertes pflanzliches Erzeugnis, das in einem Laboratorium produziert worden und nicht durch herkömmliche Kreuzung entstanden ist.

FB 215: Intragenese: InnateTM Kartoffel

Das US-amerikanische Unternehmen J.R.Simplot Company hat die intragene InnateTM Kartoffel auf den Markt gebracht, wo sie unter dem Namen »White Russet« in Supermärken feilgeboten wird. Die 2014 zugelassenen Kartoffeln sind 2016 nochmals raffiniert und zugelassen worden. Va die Knollen sind resistent gegen »Phytophthora infestans«, den Erreger der Kraut- und Knollenfäule wie Nematoden (Fadenwürmer), bleiben nach dem Anschneiden länger frisch und schwärzen nicht nach. Überdies ist es gelungen, den Asparagingehalt der Pflanze zu reduzieren, was iwF auch das in Tierversuchen Krebs erzeugende Acrylamid senkt. Die Mutationen sind insb durch Insertion von Genen der Wildkartoffel, aber auch anderer Kartoffelsorten und auch durch das gezielte Silencing (Stummschalten) erfolgt.

Wie schon bei der Cisgenese müssen auch bei der Intragenese unerwünschte Elemente nicht wieder rückgekreuzt werden. Im Unterschied zur Cisgenese nutzt die Methode der Intragenese Gen-Konstrukte, die im Ausgangsorganismus in der Form nicht vorkommen erst aus verschiedenen DNA-Fragmenten synthetisiert werden müssen.

Da die Intragenese Organismen hervorbringen kann, die über die Kreuzungszüchtung dzt nicht realisierbar sind, ist davon auszugehen, dass diese Verfahren zumindest der Risikogruppe 1 zuzuordnen sind.

Die genetische Veränderung erfolgt ua durch das Silencing, also dem Knock-down oa Stilllegen von spezifischen Genen. Methodisch wird die Genexpression in einer Zelle reguliert, indem die Expression eines bestimmten Gens unterdrückt und nicht, wie beim Knock-out deletiert, wird. Umgekehrt kann auch eine Verstärkung bestimmter Eigenschaften oder Merkmale erzielt werden.

Da die mittels Intragenese produzierten Veränderungen auf dem Austausch von Gensequenzen innerhalb von Pflanzenarten basiert, die über Kreuzungszüchtung nicht realisierbar sind. Sofern auch nur eine geringe Möglichkeit gegeben ist, dass dieselbe Veränderung sich auch in der Natur ereignen kann,[44] sollte zumindest eine Einzelfallbetrachtung in Erwägung gezogen werden.

Als GE-Mutagenese-Verfahren ist die Intragenese nicht vom Anwendungsbereich des GTR ausgenommen.

Selbst mit PCR-Methoden lässt sich das Verfahren nur nachweisen, wenn der Locus der Insertion des Intragens bekannt sind. Auch die intragene GVP kann nur dann mit PCR-Methoden erkannt werden. Kennt man sowohl die DNA-Sequenz und den Insertionslocus des Intragens, lassen sich intragene GVP mit PCR-Methoden identifizieren. Über eine methodenspezifische Anfertigung eines sog PCR-Primers kann eine konkrete Identifikationsmethode entwickelt werden.

Transgenese

Transgene Pflanzen entstehen dadurch, dass deren Genom zielgerichtet verändert wird. Im Unterschied zu den cisgenen Pflanzen wird jedoch ein artfremdes Gen in den Organismus eingeschleust.

Die landläufige Vermengung der Begriffe GVO und Transgene ist aus naturwissenschaftlicher Sicht inkorrekt, aus juristischer fallen transgene Pflanzen jedenfalls in den Anwendungsbereich des GTR. Eine artfremde Übertragung von Genen findet auf natürliche [biologische!] Weise kaum statt. Dass die Mutagenese vergleichbar zur Transgenese sein soll, lässt sich nur bedingt bejahen. Wenn es nämlich eine Veränderung am genetischen Material eines Organismus geht, wie sie auf natürliche [biologische!] Weise nicht möglich ist,[45] ist bereits die Wortwendung naturwissenschaftlich inexakt.

RNA-directed DNA Methylierung (RdDM)

Bei der RdDM (RsDM)[46] handelt es sich um eine epigenetische Modifikation. Pflanzenzüchter* können gezielt Pflanzen mit besonderen Eigenschaften hervorbringen, die weder Fremd-DNA-Sequenzen beinhalten und noch Veränderungen der Nukleotidsequenzen im Erbgut vorgenommen werden. Die Technik beruht auf dem natürlichen [biologischen!] Prozess der enzymatischen Beifügung kleiner chemischer Gruppen, wie hier die Methylgruppe[47]. Die angereicherten Nukleotide können in ihrem methylisierten Status auch nach der Zellteilung in den Tochterzellen erhalten werden, woher auch die Bezeichung epigenetische Modifikation herrührt.

Das RdDM-Verfahren reguliert demnach die Genexpression durch Zufügung von sog »markern« oder »tags« als Kennzeichnungen, um Genbereiche zu kontrollieren, wobei die Gensequenz selbst nicht verändert wird. Mit diesem Verfahren kann man jene Gene ausschalten, was als »gene switch-off» bezeichet wird, die sonst die Genexpression hin zur angestrebten Eigenschaftsverändeung nachteilig behindern würden.

Die Verfahrenstechnik setzt gewöhnlicherweise auf die Produktion intermediärer transgenetischer Pflanzen. Fremdes DNA-Material wird in die Pflanzen eingebracht, um das sog »gene silencing« durch die Gerstellung von antisense RNA-Molekülen[48] zu induzieren, sie also stumm[49] zu schalten. Das RNA-Molekül bindet an die mRNA, das eine Expression der Zielgens darstellt. Diese DSB-RNA-Moleküle lösen (triggern) wiederum die Formierung kleiner, nicht codierender RNA-Moleküle (sRNA) in der Zelle aus, die das transkriptionelle »gene silencing« durch DNA-Methylierung verursacht: Das transkriptionelle »gene silencing« wird eben durch die epigenetischen Veränderungen bedingt. Das Methylisierungsmuster, das zur Eigenschaftsveränderung führt, kann trotz Eliminierung der insertierten Gene, noch über zahlreiche Folgegenerationen erhalten bleiben.

Die intermediären Pflanzen selbst, die ein mit einem stabil integrierten Transgen ausgestattet sind, werden iSd dees GTR als GVO betrachtet, ob allerdings deren Nachkommen, sofern das Transgen (Nullsegreganten) nicht mehr enthalten ist, unter die GVO Definition fallen, darüber herrscht noch Rechtsunsicherheit.[50]

RNA-Interferenz basierte Methoden

Die RNAi[51] ist ein zelleigener Vorgang und somit ein natürlicher [biologischer!] Zellmechanismus von Eukaryoten, der dem zielgerichteten Gen-Knock-down dient oder zumindest eine Expression eindämmt. Sie zählt zu den Vorgängen des Gen-Silencing.

Kurze RNA-Stücke interagieren mit der mRNA, wobei auch hier wieder Enzyme einen wesentlichen Beitrag leisten. Die mRNA, die im Zuge der RNAi aus einer doppelsträngigen dsRNA zu kurzen bruchstückhaften, einzelsträngigen RNA prozessiert wird, enthält das zu translatierende Erbgut. Bei der RNA-Prozessierung – der Zerstückelung – kommt es zum „Abbau der endogenen mRNA“[52] wird der genetische Informationscode jedoch vernichtet bzw die Translation[53] in ein korrespondierenden Protein inhibiert.

Es gibt zwei Varianten des »gene silencing«:

  • das TGS (Transkriptionelles Gen-Silencing),
    • bei dem die epigenetische Modifikation am Gen-Locus erfolgt und
  • das PTGS (Post-Transkriptionelles Gen-Silencing),
    • bei dem die Genexpression über den RNA-Abbau gelenkt wird.[54]

Das Verfahren wird va im kommerziellen Nutzpflanzensektor angewandt, wobei die Sortenentwicklung über pflanzeneigene Gene reguliert wird (Qualitätsmerkmale). Es können aber auch die Target-Gene der Pathogene, die mit der Pflanze interagieren, modifiziert werden (Virusresistenzen).

„RNAi-basierte transgene Pflanzen fallen unter die GVO Definition nach der Richtlinie 2001/18/EG.“ [55]

Pfropfen (grafting)

http://www.transgen.de/data/media/1527/1200x900f.jpg
Abb 145: Pfropfen.[56],[57]

Das traditionelle Propfen ist an sich eine klassisch-konventionelle Methode der Kultivierung von Nutzpflanzen. Die methodische Grundlage des Pfropfens ist simpel, denn es braucht bloß ein Reis einer Edelsorte mit dem Wurzelstock zusammengefügt werden. Die neuen Pfropftechniken kombinieren jedoch das herkömmliche Verfahren mit biotechnol Techniken.[58]

Die gängigste Methode ist jene, bei der der Reis einer konventionellen Sorte auf einen gentechnisch veränderten Wurzelstock gepfropft wird. Eine Unterlage wird dabei in einem ersten Schritt gentechnisch verändert, um qualitativ zu raffinieren (Resistenzen, vermehrte Bewurzelung) und in einem zweiten wird auf sie ein herkömmlicher Reis gepfropft. Es entsteht somit eine Chimäre, die als GVO gilt, allerdings gelten die Nachkommen des Reisers selbst nicht als GVO und fallen somit auch nicht in den Anwendungsbereich des GTR. Es ist augenfällig, dass hier ein zumindest partiell gentechnisches Verfahren zur Anwendung gelangt, deren Teilprodukt kein GVO ist. Dieses Faktum ist hins der Frage nach der Einordnung von CRISPR/Cas9 ins GTR, der in Kapitel ‎‎VII. ausführlich nachgegangen wird, von erheblicher Relevanz.

Es kann aber auch im umgekehrten Wege ein GV-Reis auf einen herkömmlichen Wurzelstock gepfropft werden.

Hier spielt die Transformation des Wurzelstocks eine entscheidende Rolle. In ihm soll RNA bzw Proteine entstehen, um letztlich mit der in Kapitel ‎XXII. E. »RNAi-basierte Methoden« beschriebenen RNA-Interferenz bestimmte Gene auszuschalten bzw an ihrer Aktivität zu hindern. Auch hier wird in einem Folgeschritt ein Reis auf den GV-Wurzelstock gepfropft.

Letztlich ist auch eine Kombination beider Verfahren möglich, bei denen sowohl Reis als Wurzelstock GVO sind.

Wenn beim Pfropfen auch die Folgegenerationen des Reis‘ von der gentechnischen Manipulation betroffen sind, sind sie jedenfalls GVO und vom GTR erfasst.

Reverszüchtung (reverse breeding)

Molekularbiologisches Verfahren zur (industriellen) Reproduktion von Hybridsorten.

Das Verfahren ist – verknappt ausgedrückt – eine Umkehr der Hybridzüchtung. Wünschenswerte Eigenschaften (Merkmale) von Hybridpflanzen werden in die Elternpflanzen übertragen. Die Schwierigkeit liegt in der der heterozygoten Anlage der Hybridpflanzen. Mittels konventioneller Züchtungsverfahren lassen sich keine identischen Hybride herstellen, weil die Gene in der Phase der Meiose neu aufgeteilt und rekombiniert werden (Mendel’schen Gesetze).

Beim »reverse breeding« unterdrückt man mittels eines RNAi-Konstrukts die Rekombination, indem die für sie entscheidenden/verantwortlichen Gene stillgelegt werden (Silencing). Es werden also ein haploide Keimzellen (Chromosomensatz) hergestellt, die über konventionellen Züchtungsmethoden dupliziert werden. Genau genommen erhält man keinen diploiden, sondern zwei haploide, gepaarte, aber vollständige und hundertprozentig idente Chromosomensätze. Durch Selektion des gewünschten Pflanzenpaars (sog Doppelhaploiden) kann nun eine Rückkreuzung (homozygote Inzuchtlinien) erfolgen, wobei die reproduzierte ursprüngliche Hybridsorte keinerlei Fremd-DNA enthält.

»Reverse breeding« befindet sich noch in der Forschungsphase; Züchtungen von Kulturpflanzen sind bislang noch nicht bekannt. Wenn die aus der Reverszüchtung hervorgehenden Pflanzen als GVO einzustufen sein sollen, dann trotz der Tatsache, dass im Endeffekt keine GVP entsteht. Die rekombinante DNA hat keinen Bestand und wird nicht weitervererbt. Allerdings ist aus verfahrensorientierter Sichtweise zwischenzeitlich rekombinante DNA im Spiel, weshalb ein Freisetzungsrisiko nicht völlig auszuschließen ist.

Gene Drive und Speed Breeding

BioTech und SynBio umfassen zwar auch das Arbeiten mit Pflanzen, dennoch hinken Forschung und Entwicklung der synthetischen Pflanzenbiologie im Vergleich zu Modellheterotrophen oder Säugetieranwendungen hinterher.

Wie wichtig Pflanzen für uns sind, legt etwa das unlängst veröffentlichtes PNAS-Papier hins der globalen Biomasse unter Bedachtnahme der jew Einzelbeiträge differenter Taxa offen. Pflanzen tragen bei weitem am meisten zur globalen Biomasse bei und dominieren alle terrestrischen Ökosysteme, wobei sie auch im maritimen Bereich eine gewichtige Rolle spielen. Die Entwicklungen der letzten Jahre weisen darauf hin, dass ich DIY-Biologen* zunehmend auch der F&E von Pflanzen widmen werden.

Gegenwart

Die SynBio bei Bakterien-, Hefe- und Säugetierzellen ist wesentlich weiter die bei Pflanzen. Das Entwerfen von Schaltkreisen in Pflanzen wird va durch

  • die polyploide Natur einiger Genome,
  • die Schwierigkeit der transienten Transformation,
  • die Unfähigkeit, die Platzierung von Transgenen zu kontrollieren und
  • die langen Generationszeiten,

erschwert.

In einer Reihe von Schlüsselbereichen sind bereits Fortschritte erzielt worden, und die biotechnol Werkzeuge und Technologien werden zunehmend besser.

Jüngsten Fortschritte

Zu den jüngsten Fortschritten zählen die Möglichkeit, Schaltungsteile in Protoplasten mit einem hohen Durchsatz zu charakterisieren und auch zu »screenen«, aber auch bei gezielten Genominsertionen mittels CRISPR-Cas9 zur Verbesserungen des Pflanzenwachstums durch »Speed Breeding« sind neue Errungenschaften zu verzeichnen. Im vergangenen Jahrzehnt hat die Entwicklung modularer Klontechniken die Fortschritte in der Pflanzenwissenschaft erheblich und nachhaltig verändert.

Eine Vielzahl neuer Systeme werden eingesetzt, wie etwa

  • die Gibson-Assemblierung,
  • die Golden-Gate-Klonierung und kürzlich
  • die Loop-Assemblierung, die die einzigartige Klonierung von Nukleotidsequenzen (UNS) zum Mischen von Teilen aus verschiedenen Systemen umfasst.

BSN-Gemeinschaftsstandards für den Umgang mit Pflanzen werden geschaffen, eine offene Vereinbarung zwecks Materialtransfer und zwecks Vereinfachung der gemeinsame -Nutzung von Ressourcen werden die Open Source-Datenbanken befüllen und die Sammlung modularer Teile weltweit verfügbar machen.

Die Verbesserung der Ernteerträge ist das Ziel.

Bis vor kurzer Zeit hat man bloß ein Konstrukt pro Gen herstellen können und zwecks Stapelung einer Sorte für jede eine individuelle transgene Linie erstellt müssen. Im Anschluss hat ein aufwändiger Kreuzungsprozess Jahre der Entwicklung verschlungen. Seit der Entwicklung der »Golden Gate-Klonierung« ist man nun in der Lage ein einzelnes Multi-Gen-Konstrukt herzustellen und etwa in Reis zu insertieren, wodurch die Wartezeit bis zur Analyse verkürzt wird, da nur noch eine Transformationsrunde erforderlich ist.

Die neuen technologischen Entwicklungen ebnen den Weg für die Einführung epigenetischer Schaltkreise, um verschiedene Funktionen in Pflanzen zu erfüllen. Die technische Vision ist die Synthese eines vollständigen In-vivo-Controllers,[59] um konstante Mengen von Genen, Belastungen und Ribosomen im Hinblick auf Störungen aufrechtzuerhalten. In der Theorie ist dies bereits mehrfach gelungen, und seit kurzem gelingt das auch in der Praxis, nämlich bei dem für das DIY-Biohacking mit CRISPR/Cas9 so wichtigen E. coli. Es ist nur eine Frage der Zeit, bis synthetische Reglerentwürfe in Pflanzen in vivo implementiert werden. Es würde nicht verwundern, wenn dies sogar durch die DIY-Bio-Szene erfolgt.

Bei Pflanzen ist die Erzeugung von SVP als organische Konstrukten nur ein Teil der Herausforderung. Der Prozess des DNA-Transfers an andere Spezies bereitet wie auch die präzise Modifikation von Pflanzengenomen immer noch Probleme. Abgesehen von einigen Beispielen, wie etwa bei »arabidopsis thaliana«, bei der die Transformation durch einfaches Eintauchen in eine Lösung erfolgt, was man als »floral dip« oa Agro-Infiltration (siehe Folgekapitel) bezeichnet, werden transgene Pflanzen üblicherweise über Gewebekulturen erzeugt, was den Züchtungsprozess langwierig und teurer macht. Zudem ist das Verfahren vom Genotyp abhängig; auch die Erfolgsraten variieren stark.

Status quo

Aktuell sind nach der Erzeugung transgener Linien zwei oder drei Lebenszyklen zu durchlaufen, um homozygote Transformanten zu erhalten. Dabei tauchen immer noch zahlreiche Probleme, wie Positionseffekte durch zufällige Transgenintegration, Stummschalten oder das sog »germline mosaicism« auch »gonadal mosaicism« genannt,[60] auf. Bei 30 Pflanzen sollen idealerweise ein Screening stattfinden, um drei einzelne Insertionslinien zwecks Analyse zu erhalten. All dies erfordert die Erzeugung und Aufrechterhaltung einer Vielzahl an Kalli[61] auf Basis teurer Hormonmischungen. Für kommerziell anwendbaren Arten, bei denen eine kommerzielle Einrichtung einen Transformationsdienst anbietet, werden für Herstellung einer einzelnen transgenen Linie idR Kosten iHv mehreren TEuro anfallen.

Sicherheit

Beim Gene Drive sind noch viele wissenschaftliche Fragen zu klären, weshalb alle offiziellen Experimente in Forschungseinrichtungen entsprechend den Sicherheitsstandards des GTG erfolgen. Wenn DIY-Biologen* Gene Drive anwenden, so geschieht dies im stillen Kämmerlein. Einer pauschalen Unterstellung, wie würden die Sicherheitsauflagen nicht einhalten, lässt sich das Argument der freiwilligen Selbstunterwerfung unter die Hackerregeln, der unmittelbaren Offenbarung aller Versuchsschritte und Resultate in der »Open Science Community« und auch die erhöhten Vorsichtsmaßnahmen zur Wahrung der Anonymität entgegenhalten. Auch DIY-Biologen* wollen eine unbeabsichtigte Freisetzung von Gene-Drive-Organismen verhindern, unabhängig von einer etwaigen Einschlägigkeit des GTR.

Der dt Bundesrat hat auf Anraten vieler NGOs und Bundesländer am 07.06.2019 erhöhte Sicherheitsauflagen für Laborexperimente mit Gene-Drive-Organismen (GDO) vorgesehen und Gene-Drive in die Sicherheitsstufe 3 eingeordnet. Damit wird dieses BSN-Verfahren zugleich auch ein für alle Male dem Anwendungsbereich des GTR zugewiesen. Trotz der Neueinordnung in die Sicherheitsstufe 3 ist der ZKBS das Recht eingeräumt qua Einzelfallbewertung eine andere Sicherheitseinstufung vorzunehmen.

Um aus dem Forschungs- und Versuchsstadium in das Entwicklungsstadium zu gelangen, ist der Übertritt in ein natürliches Umfeld notwendig. Selbst das Ausweichen auf geographisch weitgehend isolierte oder auf hermetisch abgeschirmte bietet keinen verlässlichen Schutz.

Verwirktes Potenzial

Das Potenzial und das Fortschreiten neuer Züchtungstechnologien, insb der CRISPR-Cas-Methoden, ist atemberaubend und beklemmend zugleich. ges Regularien beeinflussen den Fortschritt, sie können ihn fördern oa verhindern. Nach der langen Debatte über die Einstufung von GE-Verfahren und CRISPR-Technologien als GVP/GVO-Mutagenese-Verfahren hat der EuGH in der Rs C-528/16 die Fortschrittsbremse gezogen, nicht jedoch die biowissenschaftlich fundierte Notbremse. Der immense Schaden und Nachteil für die pflanzensynthetische Biologie in der EU wird uns keine erhöhte Sicherheit einbringen, stattdessen handeln wir uns sozioökonomische Nachteile ein. Investitionen für Forschung und Entwicklung von DIY-Bio-Verfahren werden versiegen, Humankapital geht mit der Abwanderung von Expertinnen* verloren und auch der biotechnol Bildungssektor wird leiden, womit die Löcher der Abwanderung nicht zu füllen sein werden.

Die schier endlosen Anwendungsbereiche werden andernorts genutzt, wo sie außerhalb von Labors in die Praxis umgesetzt und dann in die EU importiert werden. Anstelle darüber zu debattieren, ob GVO produkt- oder prozessorientiert zu verstehen sein sollen, ist die Schaffung eines BSN-Rechts notwendig, das alle Aspekte, wie sie im Rahmen der Untersuchung behandelt worden sind, umfasst.

Agro-Infiltration (floral dip)

Bei diesem Verfahren, werden Agrobakterien – va das Agrobacterium tumefaciens – genutzt, um DNA-Sequenzen in eine Pflanze zu übertragen. Die eingesetzten genveränderten Bakterien (GVB) sind von Natur in der Lage Teile ihres Genoms auf Pflanzen übertragen. Die Genexpression ist kurzfristig und gerade nicht dauerhaft. Die Technik baut somit auf einem natürlichen Prinzip auf und nutzt diese, indem ein bestimmtes, vordefiniertes Gen eingebettet in eine kurze DNA-Sequenz mittels einer fluiden Agrobakterienkultur in einen kleinen Bereich der Pflanze eingebracht wird, wo sie letztlich das gewünschte Protein bilden soll. In concreto wird das Pflanzengewebe – meist ein Blatt – mit einer Suspension von Agrobakterien infiltriert, was zu einer auf den Gewebehabschnitt begrenzten Genexpression führt.

Die Methode eignet sich sowohl zu Bildung von Proteinen als auch zur Gen-Blockade. Das Genkonstrukt ist jedoch instabil, zu einer dauerhaften Integration der DNA in das Erbgut der behandelten Pflanze, deren Samen, Stecklinge, Töchter oder Früchte kommt es gerade nicht.

Das Verfahren gelangt va bei der Erforschung und Identifikation von Pflanzenresistenzen zum Einsatz, um iwF eine gezielte Selektion vornehmen zu können.

Die methodischen Vorteile bestehen in der Effizienz, der Geschwindigkeit und der relativen Simplizität. Ein Anwendungsfeld des Gründen Biohacking stellt die Agro-Infiltration insofern dar, als eine sie in Kombination mit CRISPR/Cas9 erfolgen kann.[62]

Der Umgang mit Agrobakterien fällt in das GTR. Seit dem EuGH-Urteil (RS C-258/46) ist das Verfahren als zielgerichtetes Mutagenese-Verfahren einzuordnen, auch wenn die Endprodukte keine GVO mehr sind, insb als sich die transferierten GV-Bakterien weder im reproduktiven Gewebe noch in der Keimbahn befinden.

Die Problematik liegt wiederum in der Unterscheidbarkeit von herkömmlichen Produkten. Selbst wenn man bei rein prozessorientierter Auslegung des GVO-Begriffs zur Einschlägigkeit des GTG gelangt, weil am Weg zur GV-freien Pflanze ein GV-Verfahren eingesetzt wird und damit zumindest zwischenzeitliches ein Risiko besteht, so stellt sich die Frage nach „cui bono“, wenn letztlich der Nachweis nicht gelingen mag?

Synthetische Genomik

Die »synthetische Genomik« ist eine Teildisziplin der SynBio. Organismen sollen mit neuen Merkmalen und Eigenschaften ausgestattet werden ohne dabei natürliche Vorlagen zu nutzen. Völlig neue Entitäten, von Basen bis zu ganzen Genomen, sollen am Reißbrett entworfen und von Grund auf synthetisiert werden.

Es handelt sich um die Schnittstelle der SynBio iwS zur SynBio ieS.

  1. SMART – Selection with Markers and Advanced Reproductive Technologies. ↑
  2. Quelle: Bericht zum Beschluss des Bayerischen Landtags vom 21.06.2017 (Drs. 17/17322) über neue Verfahren in der Gentechnologie, 29 (39). ↑
  3. Bargeld-Pflanzen (dt wörtl), gemeint sind damit für Markt erzeugtes Agrarprodukte. ↑
  4. Themenkomplex Mutagenese [S. XXXIII:77]. ↑
  5. Kap XXV. »EuGH-Urteil Rs C-528/16: „Der schwarze Mittwoch“«, S. XXV:2 ff. ↑
  6. Beachte dazu die Gegensätzlichkeit: Themenkomplex GVO-Risiko [S. XXXIII:77]. ↑
  7. EGMR (GK) 26.08.1997, 67\1996\686\876 (Balmer vs Schafroth ua gg die Schweiz), Beschwerdenummer: 22110/93; Sondervotum des Richters Pettiti: „Does the local population first have to be irradiated before being entitled to exercise a remedy?“, dt: „Muss die lokale Bevölkerung erst verstrahlt werden, ehe sie ein Rechtsmittel ergreifen kann?“ (Übersetzung durch den Verfasser). ↑
  8. Die chemischen und radioaktiven Verfahren der ungerichteten Mutagenese sind gem § 2 Abs 2 Z 4 GTG als – iSd EuGH-Urteils Rs C-528/16/EG– seit langem als sicher geltende Verfahren vom Anwendungsbereich des GTG ausgenommen. ↑
  9. MAS – Marker assisted selection. ↑
  10. Modifiziert nach Laimer M., Maghuly F., Molekulare Pflanzenzüchtung: Gezielte Veränderung einzelner Merkmale, in: Journal für Ernährungsmedizin (JEM), April 2016; 18 (1), 18-21 uVwa Jany/ Kellmann 2015 und Messmer M., Neue Züchtungstechnologien, Beurteilung gemäss [sic! Schweizer Deutsch] den Prinzipien des ökologischen Landbaus, in: Runder Tisch Neue Züchtungstechnologien AGES Wien vom 27.02.2017. ↑
  11. https://www.zukunft-pflanzenbau.at/fileadmin/Redakteure_ZP/Zukunft_Pflanzenbau/Neue_Z%C3%BCchtungstechniken/02_Vortrag_Messmer_FiBL_CH_GVO_und_%C3%96kolandbau.pdf ↑
  12. Kap XVI. I. 1. »Mutationsformen«, S. XVI:29 ff. ↑
  13. Quelle: transgen.de. ↑
  14. http://www.transgen.de/aktuell/2569.usa-crispr-pflanzen-gentechnik.html ↑
  15. Vgl Kumar V., Jain M., The CRISPR–Cas system for plant genome editing: advances and opportunities, in: Journal of Experimental Botany 2015, Bd 66, Nr 1, (47-57); DOI:10.1093/jxb/eru429 Advance Access publication 4. November 2014, Tabelle 1, 49; [Übersetzung und Modifizierung durch den Verfasser!]. ↑
  16. Jedenfalls seit dem Jahre 1996. ↑
  17. Kap XXV. »EuGH-Urteil Rs C-528/16: „Der schwarze Mittwoch“«, S. XXV:2 ff. ↑
  18. Es müssen zwei Gene in die Pflanzenzelle eingebracht werden, weil das Molekül (der Molekülverbund) aus zwei Monomeren besteht. ↑
  19. Vgl EFSA, Scientific Opinion, Scientific opinion addressing the safety assessment of plants developed using Zinc Finger Nuclease 3 and other Site-Directed Nucleases with similar function, EFSA Journal 2012; 10(10):2943, 6 (31); Kap XIX. D. 5. c) »SDN-3: Gentechnik«, S. XIX:27 f. ↑
  20. Quelle: Ebda, 7. ↑
  21. Deletion oder Insertion: Kap XVI. I. 5. a) »Punktmutationen«, S. XVI:43 ff. ↑
  22. Kap XVI. I. 5. a) »Punktmutationen«, S. XVI:43 ff. ↑
  23. Vgl EFSA [Übersetzung aus dem en Original durch den Verfasser!] sowie Nationales Forschungsprogramm NFP 59; Leitungsgruppe, Nutzen und Risiken der Freisetzung gentechnisch veränderter Pflanzen: Chancen nutzen, Risiken vermeiden, Kompetenzen erhalten: Programmsynthese NFP 59, Vdf Hochschulverlag AG an der ETH Zürich, Zürich 2012, 264 (303). ↑
  24. Deletion oder Insertion: Kap XVI. I. 5. a) »Punktmutationen«, S. XVI:43 ff. ↑
  25. Vgl EFSA [Übersetzung aus dem en Original durch den Verfasser!]. ↑
  26. Tab 44: Neuartige Pflanzen, die in den USA nicht vom GTR erfasst sind., S. XXIV:57. ↑
  27. Vgl Kumar V., Jain M., The CRISPR–Cas system for plant genome editing: advances and opportunities, in: Journal of Experimental Botany 2015, Bd 66, Nr 1, 47-57, DOI:10.1093/jxb/eru429 Advance Access publication 4. November, 2014 uVwa Jiang et al, 2013b; Li et al, 2013; Mao et al, 2013; Nekrasov et al, 2013; Shan et al, 2013a, b). ↑
  28. TALEN – Transcription Activator Like Effector Nukleasen. ↑
  29. Vgl Prink T., Metje, J., Hartung F., Plant genome editing by novel tools: TALEN and other sequence specific nucleases, Current Opinion in Biotechnology 32, April 2015, 47-53, DOI: 10.1016/j.copbio. 2014.11.010, Epub 25. November 2014. ↑
  30. Zumeist das Flokl-Bakrium (Flavobacterium okeanokoites), vgl dazu etwa Sander et al, Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA), Nat Methods 8 (1) 2011, 67-69. ↑
  31. ZFN erkennt drei Basen gleichzeitig. ↑
  32. S Tab 44: Neuartige Pflanzen, die in den USA nicht vom GTR erfasst sind., ↑
  33. Vgl dazu etwa H. Puchta H. Fauser F., Gene targeting in plants: 25 years later, in: Int. J. Dev. Biol. 57, 2013, 629-637, DOI:10.1387/ijdb.130194hp. ↑
  34. ODM – Oligonukleotid-Directed Mutagenese. ↑
  35. RTDS – Rapid Trait Development System. ↑
  36. Vgl Jahn, D. (2010). Genetik: 42 Tabellen, K. Munk (Hrsg), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York 2010, 401 f (547). ↑
  37. Deletion oder Insertion; Kap XVI. I. 5. a) »Punktmutationen«, S. XVI:43 ff. ↑
  38. Vgl Nationales Forschungsprogramm NFP 59 NFP 59, 264. ↑
  39. PCR – polymerase chain reaction; dt: Polymerase-Kettenreaktion. ↑
  40. Argentinien, Kanada und USA, vgl dazu Schriftenreihe der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der Universität Kiel 2018, Ausgabe 125, 10 f (155). ↑
  41. Ryffel G. U., Nationales Forschungsprogramm NFP 59 NFP 59, (176) 303. ↑
  42. Vgl Kost T. D. et al., „Development of the First Cisgenic Apple with Increased Resistance to Fire Blight“, Boris Alexander Vinatzer (Hrsg), Virginia Tech, United States 01.12.2015, PLoS ONE 10(12): e0143980. DOI:10.1371/journal.pone.0143980. Im Jahr 2016 ist dem Forschungsinstitut Agroscope in der Schweiz vom Bundesamt für Umwelt (BAFU) die Bewilligung erteilt worden die Eigenschaften dieses cisgenen Apfels in Freilandversuchen bis 2021 zu testen, vgl Cisgene Apfelbäume mit verbesserter Resistenz gegen Feuerbrand, in: admin.ch. Agroscope. ↑
  43. Kap XI. E. 17. b)(1)(a) »Cisgenese«,, S 688 ff; Kap XI. I. 4. c)(4) »Selbstklonieren vs Cisgenese«, S. 748 f. ↑
  44. Vgl Ryffel G. U., Nutzen und Risiken der Freisetzung gentechnisch veränderter Pflanzen: Chancen nutzen, Risiken vermeiden, Kompetenzen erhalten: Programmsynthese NFP 59, Leitungsgruppe des Nationalen Forschungsprogramms NFP 59. (Hrsg), Leitungsgruppe vdf Hochschulverlag AG, ETH Zürich 2012, (177) 303. ↑
  45. Vgl EuGH 25.07.2018, Rs C-528/16. ↑
  46. RdDM – RNA-gerichtete DNA Methylierung auch RNA-abhängige DNA-Methylierung (RaDM) genannt. ↑
  47. Die Methylgruppe wird auch als Methylrest bezeichnet, was anhand der chemischen Formel R-CH3 deutlich wird. ↑
  48. Proteinbiosynthese: Kap XVI. I. 4. b)(1) »Transkription«, S. XVI:39. ↑
  49. Detail: Kap XVI. I. 5. a)(2) »Stumme Mutation«, S. XVI:44. ↑
  50. Kap II. F. 5. »Epigenetik«, S. 48 ff. ↑
  51. RNAi – RNA-Interferenz. ↑
  52. Fuchs, Ingelfinger, Steinbrink und Boutros, Genomweite RNAi-Screens, Signalwege und Funktionelle Genomik, in: BIOspektrum, Wissenschaft – Special: Rna-Technologien, 12. Jahrgang, Juni 2006, 610. ↑
  53. Kap XVI. I. 4. b)(2) »Translation«, S. XVI:42. ↑
  54. Vgl Grundlagen zur Bewertung neuer Techniken in der Pflanzenzüchtung, BMGF 2017, 13. ↑
  55. Vgl ebda, 14. ↑
  56. Quelle: transgen.de ↑
  57. http://www.transgen.de/lexikon/1853.pfropfen.html ↑
  58. Vgl Laimer M. und Maghuly F., Molekulare Züchtung: gezielte Veränderung einzelner Merkmale, JEM April 2016, 20 f. ↑
  59. Dies gelingt mit Sensor- und Aktorfunktionen, die von den Zellen ausgeführt werden. ↑
  60. Gonosomales Mosaik. Die nach Bildung der Zygote eingetretene Mutation eines somatischen Zellteils gelangt in die Keimzellen und kann somit an Nachkommen weitergegeben werden. Weitere Mosaike: Keimzell-Mosaik und somatisches Mosaik. ↑
  61. Kallus oa callus: Regeneriertes Gewebe. ↑
  62. Kap XIX. »CRISPR/Cas-System«, S. XIX:11 ff. ↑