CRISPR/Cas-System

Das Fachmagazin »Science« bezeichnet im Jahre 2015 das CRISPR/Cas-System als naturwissenschaftlicher Durchbruch.^[1],[2] Das Faszinosum an der innovativen Methode hat längst auch eine exponentiell ansteigende Schar an DIY-Biologen*, erreicht, die ob der finanziellen Leistbarkeit von DIY-Bio-Kits oa DIY-CRISPR/Cas9-Kits^[3], des immens verkürzten Entwicklungsablaufs, der Simplizität des Verfahrens durch hervorragende Anleitungen und Vorlagen und der Verfügbarkeit von BioBricks^[4] die neuen Möglichkeiten der SynBio nutzen und »auf Teufel komm raus« losforschen.

Beim CRISPR/Cas-System handelt es sich um das innovativste und begehrteste, wenn es um die gezielt herbeigeführte Induktion von DSB geht. Auch wenn der Aufbau sog »genomischer Loci« seit den 1980er Jahren bekannt ist, insb jener von E. coli und »salmonella typhimurium«, ist die gezielte Nutzung der Autoimmunabwehr von Bakterien gegen Viren ein höchst innovativer Ansatz.^[5]

Das Um und Auf des beschriebenen Systems ist die konservierte, palindromische nukleotide, also eine (kurze) Doppelstrang-DNA-Sequenz (dsDNA-Sequenz) mit einer Länge von etwa 35 Bp, die mehrfach hintereinander im Genom aufgereiht sind. Nach jeder Sequenzrepetition folgt ein nicht konservierter Abschnitt etwa in Länge der »Spacer«. In direkter Angrenzung des CRISPR-Locus sind multiple Cas-Gene angeordnet. Das Ausmachen der Spacer als CRISPR-Locus, der originär nicht dem Wirt eigen sein konnte, sondern von Viren herkommen bzw von fremden Plasmiden stammen musste, hat schließlich zur Entdeckung der Funktion des CRISPR/Cas9 als anpassungsfähiges Immunsystem geführt.^[6]

Das auf CRISPR/Cas9-System wird dem GE zugeschrieben. Es ist nur eine der neuen Methoden des »Nuklease-vermittelten GE«, auch als »Genschere« bekannt, bei der ein Enzym über eine RNA Komponente an ihr Zielsubstrat geführt wird.^[7] Mittlerweile gibt es auch schon das noch effizientere CRISPR/Cas12-Verfahren.

Die Veränderung kann durch Insertieren vieler neuer Gene erfolgen, also komplette Synthesewege an einer vordefinierten Stelle im Genom platziert werden oder in der Insertion synthetischer Gene, die biologisch nicht bestehen bzw noch nicht beobachtet worden sind. Wendet man das Gene Drive an, zündet man einen evolutionären Booster und setzt die Mendel‘schen Gesetze außer Kraft.

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Abb 124: CRISPR Publikationen 2002 bis 2016.^[8],^[9]

Abb 125: Anzahl der weltweiten Publikationen zu CRISPR/Cas9 bis Ende 2018.^[10]

Abb 126: Studien zu GE-Verfahren bei Pflanzen.^[11], ^[12]

Abb 127: Anzahl der Genome Editing-Anwendungen nach Pflanzenarten.^[13]

Abb 128: Genome Editing-Anwendungen bei Pflanzen nach Merkmalen.^[14]

Der exponentielle Anstieg an Publikationen zu CRISPR/Cas zeugt von der für Wissenschaft und Forschung einzigartigen und bahnbrechenden Methode und der Dynamik des wissenschaftlichen Arbeitsgebiets. Das CRISPR/Cas9-System kann auch in einem kleinen (privaten) Molekularbiologie-Labor unmittelbar und ohne relevanten Kostenaufwand eingesetzt werden.

GVO über CRISPR ist, wie der Grafik abzulesen ist, vom Prinzip her, nicht völlig neu, jedoch hat die CRISPR/Cas9-Methode erst im Jahre 2012 eingesetzt. Die nachstehende Themenbehandlung orientiert sich am neuesten Wissensstand ab Juli 2017.

Es ist kein molekularbiologisches Spezialwissen notwendig, um das CRISPR/Cas9-Verfahren anwenden zu können, was es eben auch für DIY-Biologen* so verlockend macht. Unzählige Seiten im Internet und die Unterstützung durch eine weltweit interagierende und in Echtzeit kommunizierende »Open Science Community« geben für zahlreiche Versuchsschablonen im biotechnol Schwierigkeitsgrad von „Malen nach Zahlen“ vor.

Mittlerweile sind auch neue Systeme entwickelt worden, wie zB das »CRISPR-Cpf1-System«^[15], wonach das CRISPR-assoziierte Cpf1-Protein in der Lage ist sowohl RNA als auch DNA zu schneiden. Diese wissenschaftliche Weiterentwicklung ist bloß eine biotechnol Raffinesse, die auf den Inhalt dieser Arbeit keinerlei Einfluss nimmt.

Andere Methoden^[16], mit denen Wissenschafter das Erbgut beeinflussen können, sind insofern ohne Belang, als sie für die DIY-Bio zu teuer und aufwendig sind.

Auf die Existenz repetitiver DNA-Sequenzen sind bereits 1987 bei Forschungen am Bakterienstamm »E. coli K12« entdeckt worden. Diese repetitiven Abschnitte von 29 Nukleotiden, die ihrerseits von „von variablen Regionen mit jew 32 Nukleotiden unterbrochen“ werden, sind nichts anderes als CRISPR.^[17]

Der CRISPR/Cas-Mechanismus ermöglicht es Bakterien, eine Immunität gg bestimmte Bakteriophagen aufzubauen, die sogar hereditär sind. Seit dieser Entdeckung hält es Biologen* und DIY-Biologinnen* nicht mehr in ihren Sitzen. Die Entschlüsselung^[18] der Funktionsweise eines bis dato nur Fachleuten gängigen Enzyms Cas9 hat den Boom in Gang gesetzt. Cas9 erkennt die DNA der Phagen an jener Position, die zwei RNA-Moleküle (crRNA) und tracrRNA) bestimmen und durchtrennt diese an Ort und Stelle. Als Ergebnis werden virale Erreger nicht bloß außer Gefecht gesetzt, vielmehr verschafft das sog genetische Abwehrgedächtnis dem Bakterium auch eine zukünftige Infektionsabwehr. Dieses neu gewonnene Verständnis über die natürlichen [biologischen!] Aufgaben von CRISPR-Cas öffnet nicht bloß Tore für die Wissenschaft, sondern besiegelt den Aufbruch in einen neuen Abschnitt der Menschheitsgeschichte. CRISPR/Cas9 ist geboren und der Nachweis erbracht, dass das beschriebene Immunabwehrsystem von Bakterien gegen Viren auch auf andere Organismen übertragen werden kann.

Nunmehr können auch DIY-Biologe* mit dem CRISPR/Cas9-System direkte Eingriffe in das Erbgut aller möglichen Organismen vornehmen und dieses auch verändern. Eine Rechtsgrundlagenproblematik ist das juristische Outcome, mit dem auch unzählige Rechtsfolgen neu zu bewerten sind.

Während CRISPR als natürlicher Prozess selbst nicht patentierbar ist, jedoch lassen sich CRISPR-Anwendungen als Verfahrenszwecke patentieren.

Abb 129: CRISPR-Patentanträge von 2015 bis 2018.^[19]

Abb 130: CRISPR-Patente nach Lizenzhaltern*^[20]

CRISPR/Cas9: Einteilung und Methoden

Themenkomplex 177: Rekombination [S. XXXIII:77].

Typus	Organismus (Reich)	Proteine	Spaltungsdomäne	Ziel
Typ I	Bacteria (Escherichia coli) und archaea (Pseudomonas aeruginosa)	Cas1, Cas2, Cas3, Cas5, Cas6 und Cas7	HD-Nukleasedomäne von Cas3.	DNA
Typ II	Bacteria (Streptococcus thermophilus)	Cas1, Cas2, Cas9 und Cas4/Csn2	RuvC[21]-ähnliche Nukleasedomäne nahe dem N-Terminus; HNH (McrA-ähnlich) Nukleasedomäne in der Mitte von Cas9.	DNA
Typ III	Archaea (Staphylococcus epidermis, Lactococcus lactis, and Pyrococcus furiosus)	Cas1, Cas2, Cas10, und Cas6	Katalytische Triade[22] des Cas6-Proteins und des Csm/Cmr-Komplex.	DNA/RNA

Tab 42: Klassen des CRISPR/Cas9-Systems und ihre besonderen Eigenschaften.^[23]

CISPR/Cas: Nutzen/Risiko und Patente

Dem »Common-Sense« der Naturwissenschaften zufolge, besteht bei der CRISPR/Cas-Methode im Rahmen der Pflanzenzucht keine besorgniserregende Gefahr des Missbrauchs und damit auch kein erhöhtes Risiko. Bedenkt man, dass »Mutagenese« mittels radioaktiver Bestrahlung oder chemischer Behandlung von der FRL ausgenommen ist, aber wild und unwillkürlich in das gesamte Erbgut einer Pflanze eingreift, sodass unzählige Gene mitmutieren, neigt man prima vista auch als Jurist* dazu, die Ansicht der »Syn-Biologen«* zu teilen.

Das größte Potenzial dieser neuen Technologie besteht darin, Resistenzeigenschaften gegen Pflanzenpathogene zu erzeugen, wobei insb die Reaktivierung (bereits) verstümmelter Resistenz-Gene alter Kulturpflanzen bzw von Wildformen im Fokus der Forschung und Entwicklung steht.

Abb 131: CRISPR Nutzen/Risiko.^[24]

Legende

(a) Allgemeines Vorhandensein von CRISPR-Vorteilen und -Risiken / -Bedenken in populären nordamerikanischen Presseartikeln (n = 228).

(b) Spezifische CRISPR-Vorteile und -Risiken / Bedenken in populären nordamerikanischen Presseartikeln (n = 228).

Die CRISPR-Cas9 Technologie hat bereits in vielen wichtigen Nutzpflanzen Anwendung gefunden^[25]:

• Glycin max (Sojabohne),^[26]
• Triticum aestivum (Weizen),^[27]
• Zea mays (Mais),^[28]
• Gerste (hordeum vulgare),^[29]
• Potato (Kartoffel)^[30],
• Solanum tuberosum uns solanum iycopersicum (Tomate)^[31] sowie
• in verholzenden Pflanzen
  • wie Populus^[32] oder
  • Citrus^[33].

Die Gesamtdarstellung von CRISPR in den nordamerikanischen Artikeln ist in Abb Abb 131/1 dargestellt. In Bezug auf den Gesamtkontext wird CRISPR im Kontext der menschlichen Gesundheit zu 83,8% erörtert, während dies bei Tieren zu 26,3% sind und Pflanzen gar nur zu 20,6% der Fall ist. Die ethischen, rechtlichen und sozialen Fragen im Zusammenhang mit CRISPR sind in jenem Kontext,^[34] in dem CRISPR dargestellt wird (40,8%), weitaus stärker vertreten als Artikel, in denen es bei CRISPR um ökonomische Interessen (17,1%) geht. CRISPR wird fast überall als GE-Werkzeug definiert (98,7%), üblicherweise wird die CRISPR-Editierfunktion ausführlich erklärt (49,6%). Häufig werden Metaphern und Gleichnisse verwendet, wie molekulare Schere, molekulares Skalpell oder Genschere, „Copy & Paste“ oder „Suchen und Ersetzen“, in Anlehnung an Textverarbeitungsprogramme. Annähernd ein Viertel aller Artikel (24,1%) definiert CRISPR als Recherchetool, und in 18,4% wird CRISPR mit ähnlichen, älteren GT-Tools verglichen, so wie etwa TALEN oder Zinkfinger. Bei solchen Vergleichen wird CRISPR in der Regel als besser oder als Optimierung dargestellt (78,6%). In 96,1% aller Artikel werden vorteilhaften Potenziale von CRISPR dargestellt (Abb Abb 131/1a). Die drei häufigsten darunter sind die Entwicklung von Therapien bei genetischen Störungen und Krankheiten (46,9%), die Unterstützung und Verbesserung der wissenschaftlichen Forschung (34,2%) sowie die Beseitigung oder Ausrottung von Krankheit (26,3%) (Abb Abb 131/1b)^[35]. Vorteile in Bezug auf die Prävention von Krankheiten, Behinderungen und/oder ein verbessertes Screening zwecks Präventionsdiagnostik wird selten angesprochen (3,5%). In ähnlicher Weise ist eine erhöhte Lebensmittelqualität und die Erzeugung von virenresistenteren Tieren nur in geringem Maße zu verzeichnen (2,6% bzw. 2,2%).^[36]

In der EU ist die Sorge um neue BioTech wesentlich höher, wenn auch die Mär von chinesischen CRISPR-Babys medial den Ton angibt. Angesichts der globalen Befürwortung von CRISPR/Cas werden rechtlicher EU-Beschränkungen nicht vor der Invasion von CRISPR-Pflanzen schützen.

CRISPR/Cas: Tools

Das CRISPR-Werkzeug besteht aus drei Teilen:

• einer Art Sonde, nämlich der Guide-RNA^[37], die exakt an das Ziel angepasst ist,
• einer molekularen Genschere, dem Protein CAS9, das den DNA-Strang schneidet und
• einem weiteren Stückchen der RNA, dem sog tracrRNA, das beide Elemente miteinander verkoppelt.

Abb 132: „CRISPR/Cas-System mit „Sonde“ (Guide RNA) und „Schere“ (Cas9-Protein)“.^[38],^[39]

Die sog Genschere wird mit einer Erkennungssonde ausgerüstet, um die anvisierte Gensequenz in der DNA aufzuspüren, schneidet dann die entsprechende Sequenz heraus und der natürliche [biologisch] Reparaturmechanismus verbindet die losen Enden wieder miteinander. Während das Erbgut im Optimalfall erhalten bleibt, wird nur das angesteuerte Gen funktionslos. Mit der Genschere lässt sich aber auch eine DNA-Sequenz einfügen, wiederum über den Autoreparaturmechanismus und die synthetische Genmutation ist perfekt.

Abb 133: Genschere (Visualisierung).^[40]

Aus juristischer Sicht ist das der springende Punkt, denn eine Einbringung von Transgenen (bestehend aus vielen Nukleotiden) in einen Organismus bringt eindeutig einen GVO iSd § 4 Abs 3 GTG leg cit hervor. Selbst wenn die Veränderung des genetischen Materials unter natürlichen [biologischen!] Bedingungen vorkommen könnte, so wäre der hervorgebrachte Organismus womöglich iSd § 4 Abs 3 lit b) GTG dennoch ein GVO. Hier scheiden sich jedoch die Geister. Während ein TdL vermeint, es komme nicht darauf an, »wie« die DNA einer Pflanze verändert wurde, sondern »ob«,^[41] argumentiert der andere TdL, dass eine durch CRISPR/Cas9 erfolgte Deletion bzw das Knock-out einzelner Genfunktionen, wie sie auch in der Natur [biologisch!] vorkommen kann, nichts mit GVO gemein haben. Das EuGH-Urteil (Rs C-528/16) hat in der Sache kein Licht ins Dunkel gebracht.^[42]

Mit einer speziellen Software lassen sich die Zielsequenzen am Bildschirm exakt bestimmen. Speziallabore setzen das generierte CRISPR-Konstrukt, also den umprogrammierten genetischen Code, zusammen.

CRISPR/Cas-Verfahren

CRISPR/Cas ist ein Molekülkomplex. Er wird in der Natur von Bakterien als Immunisator gegen Viren eingesetzt und dient nunmehr auch den BSN als Basis zur komplexen Veränderung von Genomen.

Die aktuell populärste und meist diskutierte molekulare DNA-Schneidetechnik basiert auf der bakteriellen CRISPR-assoziierten Protein-9-Nuklease, dem Cas9, aus »streptococcus pyogenes«. Das Verfahren beruht darauf, dass Viren selbst für Bakterien eine potentielle Bedrohung darstellen, denn sie können an deren Zellen andocken und ihre schädliche DNA injizieren. Die neue Viren-DNA wird in das Erbgut des Bakteriums eingebaut und sorgt so für die Produktion neuer Viren. Das ist der landläufig bekannte natürliche [biologische!] Prozess einer viralen Infektion. Bakterien erkennen allerdings den Eindringling und speichern ihn ab und entwickeln eine Immunität gg das spezifische Virus, wobei der biochemische Vorgang ist relativ simpel ist. Das Cas9-Enzym schneidet ein Stück der viralen DNA heraus und setzen es an einer bestimmten Stelle des eigenen (bakteriellen) Genoms ein. Dieses Segment nennt man CRISPR.^[43] Die Zelle übersetzt das Segment in das cripsprRNA (crRNA) Molekül, das nunmehr beiderlei Informationen enthält; die des Virus und des Bakteriums. Im nächsten Schritt schaltet sich das tracrRNA^[44] Molekül ins Geschehen ein und heftet sich, gemeinsam mit dem crRNA Molekül, an das Cas9-Enzym, das nun das Bakterium gg genau dieses Eindringer-Virus immunisiert, weil die crRNA an die korrespondierende Viren-DNA binden kann. Nun zerschneidet das Cas9-Protein den DNA-Strang, macht ihn unschädlich und wirkungslos und wehrt somit die virale Attacke ab.

Cas9

Der erste und am besten charakterisierte Einzelprotein-CRISPR-Effektor ist das Cas9, mit dem va DIY-Biologe* bevorzugt arbeiten. Es ist bislang auch am meisten dokumentiert. Das Cas9 verursacht einen stumpfen doppelsträngigen DNA-Bruch, der dann entweder durch nicht-homologe Endverbindung oder homologe Rekombination mit einer Donor-Template-DNA repariert werden kann, um ortsspezifische Bearbeitungen zu erzeugen. Cas9 des Typs II-A weisen im Allgemeinen eine hohe Effizienz bei der Bearbeitung des Genoms auf. Off-Targets außerhalb des Ziels an unbeabsichtigten Genomstellen können auftreten, weshalb immer mehr Varianten entwickelt werden, um diese Defizit zu überwinden. Cas9 vom Typ II-C weist von Natur aus eine höhere Wiedergabetreue auf

Cas 12

Cas12 ist ein kompaktes und hocheffizientes Enzym, das die Schnitte in dsDNA in gestaffelter Weise erzeugt. Cas12 verarbeitet seine eigenen gRNAs, was zu einer erhöhten Multiplexfähigkeit führt. Cas12 wird auch als Plattform für die Bearbeitung von Epi-Genomen entwickelt. Erst kürzlich wurde entdeckt, dass Cas12a einzelsträngige DNA wahllos zerhacken kann, sobald sie durch ein Ziel-DNA-Molekül aktiviert wird, das zu seiner Spacer-Sequenz passt. Diese Eigenschaft macht Cas12a zu einem leistungsstarken Werkzeug, das auch dazu dient winzige Mengen von Ziel-DNA in einer Mischung nachzuweisen.

Cas 13

Cas13 ist ein regelrechter Ausreißer in der CRISPR-Welt, da es auf die RNA und nicht auf die DNA abzielt. Sobald es durch eine zu seinem crRNA-Spacer komplementäre ssRNA-Sequenz aktiviert wird, setzt es eine unspezifische RNase-Aktivität frei und zerstört alle in der Nähe befindlichen RNAs und zwar unabhängig von ihrer Sequenz. Diese Eigenschaft wird für die Präzisionsdiagnostik in vitro genutzt. Diese Systeme können aber auch zur effizienten, multiplexierbaren und spezifischen RNA-Knockdown- oder RNA-Sequenzbearbeitung in Säugetierzellen eingesetzt werden. Dies macht Cas13 zu einem potenziell signifikanten Therapeutikum zur Beeinflussung der Genexpression, ohne die Genomsequenz zu verändern.

Funktionsweise im Überblick

Die crRNA bestimmt also, an welcher Stelle das Cas9-Enzym den Schnitt und somit denn DSB ausführen soll, weshalb das GE-Verfahren auch Genschere genannt wird. Allerdings muss auch die tracrRNA an das Molekül gebunden sein. Die revolutionäre Entdeckung dieser beiden Funktionsweisen macht das CRISPR/Cas-System zu dem dzt populärsten Werkzeug der BSN, insb der DIY-Bio. Da sich die tracrRNA und crRNA zu einem Molekül fusionieren lassen, können Syn-Biologinnen* sie nun leichter synthetisieren. Das erstaunliche an der Entdeckung ist, dass sich das CRISPR/Cas9-System bereits bei einer geringfügigen Modifikation des Cas-Proteins bei höheren eukaryotischen Organismen, ua auch bei Menschen, anwenden und das Erbgut modifizieren lässt. Forscher* können nun äußerst präzise determinieren, wo Cas9 den DSB herbeiführt.

Damit lassen sich Gene willkürlich ausschalten, denn der zelleigene Autoreparaturmechanismus NHEJ des DSB,^[45] der aktiviert wird, sobald die Zelle einen Schaden nimmt, kann das Zusammenfügen der losen Enden nicht mehr fehlerfrei bewerkstelligen. Deshalb kann das Gen nicht mehr abgelesen werden. Es können aber auch – durch bloße Veränderung eines RNA Moleküls und ohne nennenswerten Kostenaufwand – komplette Gene ausgetauscht werden.^[46]

SDN-Systeme werden in drei SDN-Kategorien unterteilt, von denen viele Forscher* und wohl alle kommerziell ausgerichteten Züchterinnen* zumindest SDN-1 und SDN-2 vom GTR ausgenommen wissen wollen, weil sie weder die Verfahren noch die Produkte mit GVO in Zusammenhang stehend betrachten.

Funktionsweise im Detail

Vgl hierzu die ZFN-Technik

Kap XXIV. B. 1. »Zink-Finger-Nuklease (ZFN-1, ZFN-2 und ZFN-3)«, S. XXIV:59;

Kap XXIV. B. 1. a) »ZNF-1: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XXIV:60;

Kap XXIV. B. 1. b) »ZFN-2: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XXIV:61;

Kap XXIV. B. 1. c) »ZFN-3: Gentechnik«, S. XXIV:61 ff.

S zur GE-Identifizierung

Kap XI. E. 19. e) »GE-Methode: Identifizierung«, S. 700.

Die CRISPR/Cas9-Methode^[47] ist auch als Gen-Schere^[48] bekannt und ein biochemisches bzw molekularbiologisches technisches Verfahren, mit dessen Hilfe DNA gezielt zurechtgeschnitten und iwF verändert wird.

„Gene können mit dem CRISPR/Cas-System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden“.^[49]

Auch (einzelne) „Nukleotide^[50] in einem Gen können geändert werden.“^[51],[52]

Die Methode nimmt nicht bloß Anleihen an der Gentechnik, sondern wird von manchen Fachkreisen sogar als Teil der GT bezeichnet. Eine Kategorisierung, der nur bedingt beizupflichten ist,^[53] zumal, wie bereits erwähnt, die SynBio als eigenständige wissenschaftliche Disziplin anzusehen ist und das CRISPR/Cas9-Verfahren auch der SynBio zuordenbar sein kann. So stellt sich die Frage, inwieweit das GE mit CRISPR/Cas9 in die GT hineinreicht oa umgekehrt, und ob diese Überschneidung ausreicht, um das Verfahren ins GTR hineinzupressen und dann nicht als Mutagenese-Verfahren vom Regelungskonzept wieder herauszunehmen.

Vor allem Vertreter der Agrarindustrie, die sich, nach eigenen Angaben,^[54] großteils noch in der Testphase und vor Marktreife von GE-Verfahren befinden, insb aber jene, die bereits offen einräumen, das Verfahren bereits in die Entwicklungsphase gebracht zu haben,^[55] sehen keinen objektiven Grund und keinerlei Notwendigkeit gegeben, das CRISP/Cas9-Verfahren als GT zu kennzeichnen. Dieselben Protagonisten* haben aber auch erkannt, dass eine Jurisdiktion, wie sie der EuGH in der Rs C-528/16 vorgenommen hat, dazu führt sich ungeliebte Konkurrenz vom Halse zu halten.

Fakt ist, dass die Technik derart präzise und kostengünstig ist, dass innerhalb der Pflanzenwissenschaft eine (r-)evolutionäre Aufbruchsstimmung herrscht und dies weltweit. Bereits zum jetzigen Zeitpunkt steht fest, dass die Methode zu innovativen Ansätzen, Ergebnissen und bislang undenkbaren Problemlösungen führt. Diese Schlussfolgerung lässt sich auch auf alle anderen Anwendungsbereiche und wissenschaftlichen Disziplinen der BSN übertragen. Eine neuere Studie der AGES, die sich ua mit dem Thema GE mit CRISP/Cas befasst, soll weitgehend als Grundlage der nachfolgenden Ausführungen dienen.

Viren sind als besonders anpassungsfähige und raffinierte Krankheitserreger nicht nur eine Bedrohung für Mensch, Tier und Pflanze, sondern auch für Bakterien. So docken Bakteriophagen (Viren) an die Zellen von Bakterien an und schleusen ihre DNA ein, worauf diese in die DNA der Bakterien, also deren Erbgut, aufgenommen wird. Dies hat die Reproduktion neuer Viren zufolge, was letztlich den Tod der Bakterie nach sich zöge, hätte die Bakterie nicht das erwähnte Abwehrgedächtnis, das es ihnen ermöglich eine Immunität gegen das jew Virus zu entwickeln. Enzyme (wie CAS9) schneiden eine Gensequenz aus der Viren-DNA heraus und bauen es an einer bestimmten Stelle im eigenen Erbgut ein, die CRISPR-Abschnitt genannt wird. Die Zelle übersetzt diesen Abschnitt dann in ein RNA-Molekül, nämlich in die crRNA.^[56], ^[57]

Die crRNA schafft bei einer Virusattacke einen sog Spacer-Bereich, den sie mit der übereinstimmenden Sequenz auf einer Viren-DNA abgleicht und diesen dadurch erkennt. Die crRNA enthält Informationen des viralen Erregers und des Bakteriums. Daraufhin wird das Tracer-RNA-Molekül (tracrRNA) hinzugefügt und das Molekülpaar crRNA:tracrRNA an das Cas9-Enzym angebunden, das iwF genau gegen das ausgemachte Angreifer-Virus schützt, weil seine crRNA an die entsprechende Virus-DNA binden kann. Nun zerschneidet das CAS9-Protein den DNA-Strang und schaltet ihn somit aus. Die crRNA legt also für Cas9 den Schneidepunkt fest, sofern die tracrRNA auch gebunden ist.

Was also die CRISPR/Cas9-Methode zu einem solch revolutionären Werkzeug der GT macht, sind die beiden Entdeckungen, nämlich, dass

• sich die crRNA und tracrRNA zu einem einzigen Molekül fusionieren lassen, was den Produktionsprozess immens erleichtert und
• sich das modifizierte CAS9-Protein hauch funktionell in höhere Organismen transferieren lässt, sofern deren Zellen über einen Zellkern (Nucleus) verfügen.

Forscherinnen* können nun die Sequenz der fusionierten ohne Schwierigkeiten und ohne großen Aufwand variieren und selbst bestimmen, wo das Cas9-Protein den DNA-Strang zerschneiden soll. Auf diese Weise lassen sich beliebige Gene ganz gezielt ausschalten. Die Zelle kann dann die losen Enden nicht mehr fehlerfrei aneinanderfügen, was dazu führt, dass auch das Gen nicht mehr fehlerfrei abgelesen werden kann.

Ein anderer Anwendungsbereich besteht darin, komplette Gene auszutauschen, was einerseits alle bisher bekannten Techniken in den Schatten stellt und andererseits derart kostengünstig ist, dass auch DIY-Biologen* die Methode anwenden können und auch tun. Tatsächlich wird weltweit in Küchen, Kellern, Garagen und sogar Kinderzimmern herumexperimentiert, wobei der Arbeitsvorgang extrem simpel ist, zumal bloß ein RNA-Molekül verändert werden muss.

SDN-1: Gentechnik? im kleinen Rahmen

Vgl hierzu die ZFN-1-Technik

Kap XXIV. B. 1. a) »ZNF-1: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XXIV:60;

Bei SDN-1-Anwendungen werden Mutationen, die aus Änderungen einiger Basenpaare, kurzen Deletionen oder Insertionen (Indels) bestehen, in einer vordefinierten Region im Genom als Ergebnis eines fehleranfälligen Genreparaturmechanismus der Zelle (NHEJ) erzeugt.

Der Reparaturmechanismus erfordert keine exogen gelieferte DNA.

Eine sgRNA-Cas9^[58] Aktivität wird in lebende Zellen eingeschleust und führt zu einem gezielten DSB in der DNA. Das NHEJ repariert den DSB, wobei die zielgerichtet herbeigeführte Mutation in nicht exakt vorhersehbarer Weise erfolgt. Aus mehreren, nur wenige Nukleotide umfassenden Mutationen habe Forscher* dann die richtige zu selektieren, was keinen relevanten Aufwand bedeutet.

SDN-1 umfasst demnach die Methoden des Austauschs, der Insertion oder der Deletion einzelner oder einer geringen Anzahl von Nukleotiden, weshalb gerne argumentiert wird, dass es sich bei SDN-1 um keine GT handle. Setzt man zwei punktgenaue DSB, wird die eingeschlossene DNA-Sequenz deletiert.

IdR wird das Knock-out bestimmter Genfunktionen angestrebt. Fremd-DNA (Donor-DNA) oder vorgefertigte Reparaturvorlagen werden nicht eingesetzt.

In der NPBT

• eliminiert man somit unerwünschte Substanzen, wie Allergene, Toxine, …;
• erhöht das Aufnahmepotenzial einer Pflanze, wie Nährstoffe, Wasser, Öle, …;
• entwickelt oder reaktiviert Resistenzen gegen gewisse Krankheiten oder parasitären Befall, was eine erhebliche Einsparung an Pestiziden und Fungiziden in der Pflanzenzucht bedeutet.

SDN-2: Gentechnik? im kleinen Rahmen

Vgl hierzu die ZFN-2-Technik

Kap XXIV. B. 1. b) »ZFN-2: Gentechnik? im kleinen Rahmen«, S. XXIV:61;

Bei SDN-2-Anwendungen werden spezifische Punktmutationen,^[59] kleine Deletionen oder Insertionen als Resultat der Einführung einer Reparatur-DNA-Matrize (Donor-DNA) in die Zelle erzeugt, die homolog zu dem Zielgebiet sind.

Durch homologe Rekombination (HR) kann eine präzise und geringe genetische Veränderung erreicht werden.

Eine ortsspezifisch angefertigte (enzymatische) sgRNA-Cas9 Aktivität wird in Kombination mit DNA als HDR-Reparaturvorlage^[60], in eine Zelle eingebracht und schafft einen punktgenauen DSB.

Während der – im Pflanzen- und Tierreich vorkommende – Autoreparaturmechanismus des NHEJ zu Fehlern führen kann, nutz jener des HDR – wie er bei Mikroorganismen vorherrschend ist – also eine Matrize, um die Schäden auszugleichen. der NHEJ Prozess verknüpft die beiden DSB Enden ohne Matrize, was Narben, in Form von Insertions- bzw Deletionsmutationen hinterlässt, was in der biotechnol Terminologie als »Indel«, also der Verschmelzung von Insertion und Deletion, bezeichnet wird.

Abb 134: NHEJ geleitete DSB-Reparatur vs HDR Mechanismus.^[61]

Die insertierte DNA ermöglicht eine homologe Mutation beider DNA-Stränge. Wiederum nutzt man den zelleigenen Reparaturmechanismus der Zelle, um die codierte Matrize zielgenau an der Fehlstelle zu platzieren und die Sequenzänderung im Genom qua Replikationsvorgang zu implementieren.

Auch hier werden Mutationen im Ausmaß von wenigen Nukleotidpaaren bewerkstelligt bzw Insertionen oder Deletionen angebracht. Zumeist wird das SDN-2-Verfahren in Verbindung mit SDN-3 angewandt, womit aus rechtlicher Sicht die Kombination mit der jedenfalls ins GTR fallende SDN-3-Vefahren automatisch auch das SDN-2-Verfahren zum GV-Verfahren macht. Eine Deaktivierung natürlicher Gene ist ebenso wenig auszuschließen wie eine »Off-target-Insertion«.

SDN-3: Gentechnik

Vgl hierzu die ZFN-3-Technik

Kap XXIV. B. 1. c) »ZFN-3: Gentechnik«, S. XXIV:61.

Bei SDN-3-Anwendungen können ganze Gene an einer gewünschten Stelle im Genom insertiert werden. Dies wird durch die Abgabe eines großen Teils des rekombinanten DNA-Moleküls (einer exogenen Spender-DNA mit einer Länge von bis zu mehreren Kilobasen) ermöglicht.

Die Einfügung kann entweder durch HR oder durch NHEJ erfolgen.

Wie bei SND-2 wird eine sgRNA-Cas9 Aktivität in Kombination mit einer Reparaturmatrize, die zusätzlich eine längere rekombinante DNA-Sequenz enthält, ^[62] an einen spezifischen Insertionspunkt einer Zelle (oa mehrerer Zellen) eingebracht, um neue biologische Funktionen zu kreieren. Der Replikationsvorgang^[63] sorgt für den punktgenauen Einbau des neuen DNA-Segments in die endogene DNA-Sequenz.

Off-target-Risiken

CRISPR-Cas9-Schnitte können also auch an Orten erfolgen, die nicht angepeilt waren, also außerhalb des Zielbereichs liegen. Die Problematik wird va von Gegnerinnen* der GT und der BioTech hochgespielt.

Fakt ist, dass es im Zuge der ersten Euphorie um CRISPR/Cas9 zu übereilten Aussagen hins der Exaktheit und geringen Fehleranfälligkeit der Methode gekommen ist. Off-Target-Effekte bringen Fehlmutationen hervor, so auch bei GE-Verfahren.^[64]

Fakt ist aber auch, dass die Quantität der Off-target-Effekte bei zugelassenen ungerichteten Mutagenese-Verfahren um ein Tausendfaches höher liegt.^[65]

Man muss sich dennoch ins Bewusstsein rufen, dass die Enthüllungsberichte, gepackt in Hiobsbotschaften erstaunlich verdichtet vor dem EuGH-Urteil (Rs C-528/16) publiziert worden sind. Es werden jedoch laufend neue Methoden entwickelt werden, um etwa die Cas9-Spezifität zu verbessern,^[66] was das Risikopotenzial auf ein Minimum senkt.

Durch die Erweiterung des Genom-Editierungspotenzials des CRISPR/Cas9-Systems durch Desaminase-vermittelte Hypermutation zeige Target-AID^[67] einen sehr engen Bereich der zielgerichteten Nukleotidsubstitution ohne die Verwendung von Template-DNA. Nickase Cas9- und Uracil-DNA-Glycosylase-Inhibitorprotein könnten zur Steigerung der Targeting-Effizienz verwendet werden. Die verringerte Zytotoxizität sei vorteilhaft für die Verwendung in Zellen, die ggü künstlichen Nukleasen empfindlich seien. Die Verwendung anderer Typen von Nukleotid-modifizierenden Enzymen und/oder anderen zu CRISPR verwandten Systemen mit unterschiedlichen PAM-Anforderungen^[68] würde das Repertoire und die Kapazität zur Bearbeitung von Genomen erweitern.^[69]

GE mit CRISPR/Cas9 beruht darauf, dass die transformierten Zellen in vitro kultiviert werden. Jeder Arbeitsschritt in BSN-Verfahren bedeutet zugleich auch das Eröffnen einer neuen Gefahrenquelle. Die Präzision des CRISPR/Cas9-Systems steht und fällt mit der Sorgfalt der Anwenderin*, die es der Hand hat, die Versuchsanordnung weitgehend zu perfektionieren und ungewünschte Modifikationen zu vermeiden. Je besser die Verfahren und Methoden werden, desto geringer werden auch die Off-target-Effekte sein. Im Unterschied zur Züchtung mit Methoden der ungerichteten Mutagenese, haben Syn-Biologen* ua DIY-Biologinnen* immensen Einfluss auf den Verlauf der Mutagenese und können die Fehlerquote auf ein Minimum, mglw bald schon ausschließen.

Bio-Safety, Bio-Security und Bio-Präzision

Themenkomplex 178: Biosafety und Biosecurity [S. XXXIII:77].

FB 210: Wer weiß, dass er nicht weiß, weiß nicht, von dem … Risiko

Sofern der Mensch Typ A weiß, dass er etwas nicht weiß, ist er verunsichert. Genauso verunsichert ihn alles, von dem er nicht weiß, dass er es nicht weiß. Weiß er, dass er etwas nicht wissen kann, wägt er ab. Glaubt er etwas zu wissen, von dem er de facto nichts weiß, so kennt seine Risikobereitschaft keine Grenzen.

Eben dieser Mensch Typ A weiß, dass er über die Funktionsweise der Gene und des Genoms so gut wie nichts weiß. Der Experte*, also Mensch Typ B, weiß zumindest, dass sein Wissen sehr begrenzt ist, er aber täglich dazulernt und dh kalkuliert er, rechnet hoch und wagt. Er weiß, Gene machen etwa zwei Prozent eines Genoms aus; die Funktion der Gene ist zu einem Teil bekannt und in Datenbaken abgespeichert. Die Unsicherheit bezieht sich va auf die verbleibenden 98 Prozent der DNA.

Ein Genom besteht nicht bloß aus Code, der beliebig umzuprogrammieren ist. Jede Modifikation löst irgendetwas aus, führt also zu einer Reaktion, die verheerend oder vernachlässigbar sein kann. Auch Kettenreaktionen oder multiple Reaktionen sind nicht auszuschließen. Ein Genom ist dynamisch zu verstehen und nicht als statische Entität. Hierin liegt der wesentliche Unterschied zu elektronischen Speichersystemen.

Genome sind perfekte Speichermedien, die aber eine biochemische und keine KI aufweisen. Die organisieren, regulieren und (re)programmieren sich selbst, passen sich also autonom an veränderte Umweltbedingungen (Epigenetik) an und reparieren ihre eigenen Defekte selbst. Auch die effizientesten BSN-Methoden können nur im Rahmen des Wissenstandes der ausführenden Personen angewandt werden. Dh die Methoden können helfen, die Funktionsweisen besser zu verstehen, können aber auch nur im Rahmen des bestehenden Wissens präzise sein.

Ängstliche Charaktere wagen sich gerade einmal an diese Grenzen, Rationalisten* loten die Risiko-Wahrscheinlichkeiten aus und definieren danach ihre Grenzen. So reicht es dem rational denkenden Naturwissenschafter* mitunter, wenig über die Abläufe des DNA-Autoreparaturmechanismus selbst zu wissen, sofern er* sich sicher sein kann, dass er nach einem erfolgten CRISPR/Cas9-Eingriff auch einsetzt.

Hasardeure* spielen „va banque“ und riskieren blind, getrieben bloß durch ein Fünkchen Hoffnung. Kriminelle und Bösartige wollen anderen Menschen und/oder der Umwelt Schaden zufügen und negieren Biosafety und Biosecurity^[70] bewusst. Und dann gibt es noch die Vernünftigen, die lieber die Finger vom Unbekanntem lassen und die Unvernünftigen, die sich alles zutrauen, glauben alles im Griff zu haben und selbst überschätzen.

Wie sich der Einzelne* zum Thema Risikoeinschätzung zu positionieren hat, ist nicht Aufgabe dieser rechtswissenschaftlichen Untersuchung.

Nach aktuellem Stand der Dinge sind GE-Mutagenese-Verfahren vom Anwendungsbereich des GTR erfasst und werden demnach als GT-Mutagenese-Verfahren eingestuft, Für alle anderen BSN-Verfahren ist ein ges Rahmen notwendig.

1. Vgl Science News Staff: Breakthrough of the Year: CRISPR makes the cut, 17. Dezember 2015. ↑
2. http://www.sciencemag.org/news/2015/12/and-science-s-2015-breakthrough-year ↑
3. Detail: Kap XIX. XX. »DIY-Bio-Kits«, S. XX:30 ff. ↑
4. Detail: Kap XXII. »BioBricks«, S. XXII:47 ff. ↑
5. Vgl Stern, M. J., Ames, G. F., Smith, N. H., Robinson, E. C. & Higgins, C. F., Repetitive extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome, in: Cell, Bd 37, Ausgabe -Nr 3, Elsevier Inc., Cambridge, Massachusetts 1984, 1015-1026, DOI: 10.1016/0092-8674(84)90436-7. ↑
6. Vgl Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D. A., Horvath P, CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, New York 2007, Bd 315, Ausgabe -Nr 5819, 1709-171, DOI: 10.1126/science.1138140; Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich, S. D, Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin, in: Microbiology, Bd 151 (Pt 8), Microbiology Society, London 2005, 2551-2561, DOI:10.1099/mic.0.28048-0. ↑
7. Vgl Grundlagen zur Bewertung neuer Techniken in der Pflanzenzüchtung: RNA-abhängige Techniken, Accelerated Breeding und CRISPR-Cas, BMFG 2017, 2. ↑
8. Quelle: PubMed; Bildrechte: Lluís Montoliu. ↑
9. http://wwwuser.cnb.csic.es/~montoliu/CRISPR/ ↑
10. Quelle: Mazhar Adli, The CRISPR tool kit for genome editing and beyond, in: Nature Communicationsvolume 9, Article number: 1911 (2018), Abb 2: „CRISPR-based genome-targeting tools are widely used. Number of PubMed publications over the last 12 years that had the word “CRISPR” or “Cas9” in the abstract or title. **Number of publications in 2018 is projected to be more than 5000“. ↑
11. Quelle: transgen.de uVwa JKI. (2018 basiert auf einer Hochrechnung). ↑
12. https://www.transgen.de/aktuell/2723.publikationen-genome-editing-crispr.html ↑
13. Quelle: ebda: „Die Übersicht des JKI stuft 102 Anwendungen als „marktorientiert“ oder „marktreif“ ein. Diese umfassen 33 Kulturpflanzenarten.“ ↑
14. Quelle: ebda: „Die meisten Projekte haben Ertragssteigerungen oder eine Verbesserung der Produktqualität – wie z.B. veränderte Fettsäuremuster, mehr gesundheitsfördernde Inhaltsstoffe, längere Haltbarkeit – zum Ziel.“ ↑
15. Vgl Fonfara I., Richter H., Bratovič M., Le Rhun A. und Charpentier E.s, The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA, in: Nature, International Weekly Journal of Science (28.04.2016), Nr 532, 517-521, Online-Veröffentlichung am 20.04.2016 sowie Sorek R., Kunin V., Hugenholtz P., CRISPR-a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea, in: Nature reviews, Microbiology, Bd 6, Nr 3, März 2008, 181-186. ↑
16. Restriktionsenzyme, Zinkfinger-Nukleasen, Meganukleasen, TALEN etc. ↑
17. Vgl Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M. und Nakata A., Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology 169(1987), 5429-5433. ↑
18. Die Entschlüsselung ist der fr Mikrobiologin Emmanuelle Charpentier und US-amerikanischen Strukturbiologin Jennifer Doudna im Jahre 2012 gelungen. ↑
19. Quelle: IAM. ↑
20. Quelle: IAM. ↑
21. Die RuvC-Nuklease (Dimer-Endonuklease) initiiert den DSB, der nicht komplementär zur gRNA ist, vgl ZKBS, Stellungnahme zu gentechnischen Arbeiten mit enterohämorrhagischen E.-coli-Stämmen (EHEC), in: Bundesgesundheitsblatt – Holliday junction substrate, in: Nucleic Acids Res. 41 (21), November 2013, EPub am 24. August 2013, PMCID: PMC3834835, PMID: 23980027, DOI: 10.1093/nar/gkt7699 945–9955 (2013). ↑
22. Spezielle Anordnung dreier Aminosäuren im aktiven Enzym-Zentrum. ↑
23. Vgl Kumar V., Jain M., The CRISPR–Cas system for plant genome editing: advances and opportunities, in: Journal of Experimental Botany 2015, Bd 66, Nr 1, (47-57); DOI:10.1093/jxb/eru429 Advance Access publication 4. November 2014, Tabelle 2, 50; [Übersetzung und Modifizierung durch den Verfasser!]. ↑
24. Quelle: IAM. ↑
25. BMGF, Grundlagen zur Bewertung neuer Techniken in der Pflanzenzüchtung: RNA-abhängige Techniken, Accelerated Breeding und CRISPR-Cas, BMFG 2017, 4. ↑
26. Ebda mVwa Li, Z., Liu, Z.-B., Xing, A., Moon, B. P., et al., Cas9-Guide RNA Directed Genome Editing in Soybean. Plant physiology 2015, 169, 960-970. ↑
27. Ebda mVwa Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R., RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics 2013, 3, 2233-2238. ↑
28. Ebda mVwa Svitashev, S., Young, J. K., Schwartz, C., Gao, H., et al., Targeted Mutagenesis, Precise Gene Editing, and Site-Specific Gene Insertion in Maize Using Cas9 and Guide RNA. Plant physiology 2015, 169, 931-945. ↑
29. Ebda mVwa Lawrenson, T., Shorinola, O., Stacey, N., Li, C., et al., Induction of targeted, heritable mutations in barley and Brassica oleracea using RNA-guided Cas9 nuclease. Genome biology 2015, 16, 258. ↑
30. Ebda mVwa Wang, S., Zhang, S., Wang, W., Xiong, X., et al., Efficient targeted mutagenesis in potato by the CRISPR/Cas9 system. Plant Cell Reports 2015, 34, 1473-1476. ↑
31. Ebda mVwa Brooks, C., Nekrasov, V., Lippman, Z. B., Van Eck, J., Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system. Plant physiology 2014, 166, 1292-1297. ↑
32. Ebda mVwa Fan, D., Liu, T., Li, C., Jiao, B., et al., Efficient CRISPR/Cas9-mediated Targeted Mutagenesis in Populus in the First Generation. Scientific reports 2015, 5. ↑
33. Ebda mVwa Jia, H., Wang, N., Xcc-facilitated agroinfiltration of citrus leaves: a tool for rapid functional analysis of transgenes in citrus leaves. Plant Cell Reports 2014, 33, 1993-2001. ↑
34. Einschließlich des Diskurses über die rechtlichen Auseinandersetzungen um CRISPR-Patente (16,7%). ↑
35. Alle Vorteile, die in mindestens 3% der Artikel gennant sind. ↑
36. Vgl Marcon, A., Master, Z., Ravitsky, V. et al, CRISPR in the North American popular press, in: Genet Med 21, 2184-2189 (2019). DOI:10.1038/s41436-019-0482-5 ↑
37. Zumal die internationale Bezeichnung RNA und DNA (A für acid) und nur im deutschsprachigen Raum zT die Begriffe RNS und DNS (Dt: S für Säure; En: A für acid) verwendet werden. ↑
38. Quelle: transgen.de ↑
39. http://www.transgen.de/forschung/2564.crispr-genome-editing-pflanzen.html ↑
40. Quelle: thinkstock.com, wildpixel. ↑
41. Vgl Krämer L., Legal questions concerning new methods for changing the genetic conditions in plants, Legal analysis commissioned by Arbeitsgemeinschaft bäuerliche Landwirtschaft (AbL), Bund für Umwelt und Naturschutz (BUND), Bund Ökologische Lebensmittelwirtschaft (BÖLW), Genethisches Netzwerk, Greenpeace, IG Saatgut, Testbiotech and Zukunftsstiftung Landwirtschaft, 2015. ↑
42. Kap XXV. H. »Diskussionsstatus ante Rs C-528/16«, S. XXV:56 ff und Kap XXV. »EuGH-Urteil Rs C-528/16: „Der schwarze Mittwoch“«, S. XXV:2 ff. ↑
43. Phonetik: »krisper«. ↑
44. Phonetik: wie das en Wort »tracer«; Bedeutung: Sucher. ↑
45. Etwa 99 % bei Pflanzen und 90% bei Tieren, vgl BVL, Wissenschaftlicher Bericht zu den neuen Techniken in der Pflanzenzüchtung und der Tierzucht und ihren Verwendungen im Bereich der Ernährung und Landwirtschaft, 19. Juli 2017, 16 (77). ↑
46. Detail: Kap XIX. D. 5. »Funktionsweise im Detail«, S. XIX:23 ff. ↑
47. Cas9 – ist eine Endonuklease und ein Ribonukleoprotein aus Bakterien. ↑
48. Auch „Skalpell für das Erbgut“ bezeichnet, vgl dazu Max-Planck-Gesellschaft, Max-Planck-Filme vom 30. September 2016. ↑
49. Jinek Martin, Chylinski Krzysztof, Fonfara Ines, Hauer Michael, Doudna Jennifer A., Charpentier Emmanuelle, A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity, in Science. Bd 337, Nr 6096, 17. August 2012, 816–821. ↑
50. [Ergänzungen und Hervorhebungen erfolgten durch den Verfasser und sind nicht Bestandteil des Originals]. ↑
51. Ochiai, H., Single-Base Pair Genome Editing in Human Cells by Using Site-Specific Endonucleases In: International journal of molecular sciences, Bd 16, Nr 9, 2015, 21128–21137. ↑
52. https://de.wikipedia.org/wiki/CRISPR/Cas-Methode ↑
53. Sofern CRISPR/Cas9 ein Mutagenese-Verfahren entsprechend den fehlerhaften Ausführungen des EuGH in der Rs C-528/16 ist. ↑
54. Bayer und Monsanto, vgl dazu WDR, Gentechnik durch die Hintertüre vom 25.01.2017. ↑
55. „Der Saatguthersteller DuPont hat einen angeblich ertragreicheren Mais entwickelt, der in vier Jahren auf den US-Markt kommen soll.”, ebda. ↑
56. Transkription des Reports „Gen-editing mit CRISPR/Cas9“ im WDR, veröffentlicht unter: YouTube. ↑
57. https://www.youtube.com/watch?v=ouXrsr7U8WI ↑
58. Sg – single guided, dt: Einzelstrang geführt. ↑
59. Deletion oder Insertion: Kap XVI. I. 5. a) »Punktmutationen«, S. XVI:43 ff. ↑
60. Auch Reparaturmatrize genannt. ↑
61. Quelle: Ran et al, Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system, Protocols 8, Nature 2013, 2281-308. ↑
62. Hierbei werden nicht mehr ein bis einige wenige Nukleotide eingebracht, sondern DNA Sequenzen von bis zu mehrere Tausend Nukleotiden eingeschleust. ↑
63. Oa Reparaturmechanismus. ↑
64. Kap XVIII. A. 1. c) »Genome Editing (GE)«, S. XVIII:5 ff und Kap XXIV. »Genome-Editing in der Pflanzenzüchtung«, S. XXIV:53 ff. ↑
65. Themenkomplex Mutagenese [S. XXXIII:77]. ↑
66. Vgl exemplarisch Cromwell C. R. et al, Incorporation of bridged nucleic acids into CRISPR RNAs improves Cas9 endonuclease specificity, in: Nature Communications 1448 (9), 13.04.2018, DOI: 10.1038/s41467-018-03927-0 oder Nishida K. et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. In: Science, Bd 353, Ausgabe 6305, 04.08.2016, DOI: 10.1126/science.aaf8729. ↑
67. AID – activation-induced cytidine deaminase. ↑
68. PAM – protospacer adjacent motif. ↑
69. Nishida K. et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. In: Science, Bd 353, Ausgabe 6305, 04.08.2016, DOI: 10.1126/science.aaf8729; [Übersetzung aus dem en Original, Zitation und Hervorhebungen durch den Verfasser!]. ↑
70. Themenkomplex Biosafety und Biosecurity [XXXIII:77]. ↑